一種快速檢測羊水中胎兒細胞vhl基因突變的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及羊水胎兒細胞VHL基因突變檢測的方法和試 劑盒。
【背景技術】
[0002] VHL基因（M頂編號608537)定位于3p25-26,全長10KD，包含三個外顯子和兩個內 含子，可轉錄形成兩種mRNA。包含三個外顯子轉錄產物的mRNA翻譯出p30 (213個氨基酸） 和pl9 (159個氨基酸）蛋白。pl9是VHL基因第二轉錄起始位點（54號密碼子）轉錄形成 的異構體，與p30功能相似。
[0003] VHL基因突變方式多樣，包括點突變、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位點突 變等。目前檢測VHL基因突變最常用的方法是PCR直接測序，準確率為38 %~80 %，這是 由于PCR測序檢測技術只能檢測點突變、小片段缺失或插入、剪切位點突變，不能檢測VHL 基因大片段缺失，然而VHL大片段缺失的發生率為11%~40%。目前國內外用于VHL基因 大片段缺失檢測的方法包括印記雜交法SouthernBlot、多重連接探針擴增技術MLPA、逆轉 錄法RT-PCR及通用引物熒光定量PCR法UPQFM-PCR等。SouthernBlot和MLPA具有檢測 方法操作繁瑣，價格昂貴，不適于推廣應用等缺陷，且上述VHL基因突變的檢測樣本多為外 周血，目前還沒有對羊水中胎兒細胞的VHL基因進行檢測的方法，一方面由于提取羊水時， 羊水中可能會受到母體遺傳物的污染，影響檢測結果；另一方面，目前的應用于外周血等檢 測樣本的VHL基因檢測方法，檢測周期長，檢測成本高，不利于VHL基因的快速準確的檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的問題，提供一種操作簡單、檢測 快速、結果準確且成本低廉的胎兒細胞VHL基因突變檢測方法和試劑盒。
[0005] 為實現本發明的目的，本發明一方面提供一種快速檢測羊水中胎兒細胞VHL基因 突變的方法，包括：
[0006] 通過提取羊水中胎兒細胞的DNA，獲得DNA溶液；
[0007] 對所述的DNA溶液進行母體遺傳物質污染的檢測，判斷DNA溶液中是否存在母體 遺傳物質污染；
[0008] 若判斷DNA溶液中不存在母體遺傳物質污染，則直接對胎兒細胞進行VHL基因突 變檢測；
[0009] 若判斷DNA溶液中存在母體遺傳物質污染，則對羊水中胎兒細胞進行培養傳代后 再進行VHL基因突變檢測。
[0010] 其中，所述母體遺傳物質污染檢測包括：
[0011] 人工合成人類性別決定基因SRY和X染色體上的3個短串聯重復序列DXS6797、 DXS6807、AR的擴增引物對1-4 ;
[0012] 利用所述擴增引物對1-4和所述DNA溶液建立PCR擴增反應體系，進行PCR反應， 得到PCR擴增產物；
[0013] 對所述PCR擴增產物中的SRY基因擴增產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，對所述 PCR擴增產物中的DXS6797、DXS6807和AR基因的擴增產物進行STR分析，根據所述SRY基 因擴增產物的電泳結果和STR分析結果判斷所述DNA溶液中是否存在母體遺傳物質污染。
[0014] 其中，所述利用所述擴增引物對1-4和所述DNA溶液建立的PCR擴增反應體系是： 總體積為25y1，包括12. 5y1的PCRmix、20-80ng的DNA模板、0. 5y1的擴增引物和余量 的CldH2O;反應條件是：在95°C溫度條件下預變性5min;95°C變性20s，SRY基因、DXS6797、 DXS680755°C退火 20s，AR58°C退火 20s，72°C延伸 20s，30 個循環后 72°C復性 5min，4°C保 存。
[0015] 特別是，所述擴增引物對1-4如SEQIDNO. 1-8所示，分別為：
[0024] 其中，所述擴增引物對2中DXS6797-F引物的5'端標記FAM熒光。
[0025] 其中，所述擴增引物對3中DXS6807-F引物的5'端標記FAM熒光。
[0026] 其中，所述擴增引物對4中AR-F引物的5 '端標記FAM熒光。
[0027] 其中，所述VHL基因突變檢測包括：
[0028] 采用熒光原位雜交探針對所述羊水中胎兒細胞進行VHL基因大片段缺失的檢測， 獲得所述胎兒細胞是否存在大片段缺失的檢測結果。
[0029] 特別是，所述熒光原位雜交探針上標有熒光信號，由具有SEQIDNO. 15-20所示的 堿基序列的探針引物對8-10進行PCR制備得到。
[0030] 其中，所述探針引物對8-10如SEQ
ID NO. 15-20所示的堿基序列，包括：
[0037] 其中，所述由具有SEQIDNO. 15~20所示的堿基序列的探針引物進行PCR制備 得到的雜交探針的大小為300_1000bp。
[0038] 進一步優選地，所述由具有SEQIDNO. 15~20所示的堿基序列的探針引物進行 PCR制備得到的雜交探針的大小為300-800bp。
[0039] 進一步優選地，所述由具有SEQ ID NO. 15~20所示的堿基序列的探針引物進行 PCR制備得到的雜交探針的大小為300-500bp。
[0040] 其中，所述采用熒光原位雜交探針對所述胎兒細胞進行VHL基因大片段缺失的檢 測包括：
[0041] 利用已采集的羊水中胎兒細胞制備細胞涂片；
[0042] 將所述熒光原位雜交探針置于雜交液中與所述細胞發生雜交反應，獲得雜交產 物；
[0043] 洗滌所述雜交產物，并進行細胞核染色，獲得核染色后的細胞涂片；
[0044] 通過熒光顯微鏡觀察所述核染色后的細胞涂片，判斷待測樣本的DNA是否發生了 VHL基因大片段缺失。
[0045] 其中，所述利用已采集的羊水中胎兒細胞制備細胞涂片還包括：對采集得到的羊 水中胎兒細胞進行培養傳代。
[0046] 特別是，所述對羊水中的細胞進行培養傳代是指在預先配制的胎兒細胞培養液中 進行培養傳代，其中培養溫度為37°C，空氣中0)2的體積百分比為5%。
[0047] 特別是，所述胎兒細胞培養液由70-79%的hyclonedmem/fl2培養基、20-28%胎 牛血清FBS和1-2%的青霉素和鏈霉素雙抗PS配制而成。
[0048] 優選地，所述胎兒細胞培養液由74%的hyclonedmem/fl2培養基、25%胎牛血清 FBS、1 %的青霉素和鏈霉素雙抗PS配制而成。
[0049] 其中，所述制備細胞涂片的步驟包括：通過離心獲得待測樣本中的細胞，經磷酸鹽 緩沖液離心和KCl低滲處理后，用固定液固定所述細胞的形態，制成細胞涂片；將所述細胞 涂片進行老化處理，經胃蛋白酶消化處理后，進行酒精梯度脫水，得到細胞涂片。
[0050] 其中，所述固定液是由體積比為3:1的甲醇和冰醋酸配制而成。
[0051] 其中，所述雜交液是是由體積比為5:1:1:3的甲酰胺、20xSSC、硫酸葡聚糖和水配 制而成。
[0052] 其中，所述老化處理是將所述細胞涂片在56°C條件下在烤片機上處理20min。
[0053] 其中，所述老化處理還可以是在15_30°C的室溫條件下過夜放置12_16h。
[0054] 特別是，所述采用熒光原位雜交探針對所述胎兒細胞進行VHL基因大片段缺失的 檢測還包括：熒光原位雜交探針的制備。
[0055] 其中，所述熒光原位雜交探針的制備包括：在人類基因組中篩選用作FISH探針的 VHL基因序列，通過克隆引物對11-13獲得目的基因片段；將得到的基因片段連接到質粒 中，獲得含有目的基因片段的質粒；將所述質粒在大腸桿菌中進行擴增，提取質粒后，得到 質粒溶液；利用探針引物對8-10、熒光原料和所述質粒溶液制備具有熒光染料標記的熒光 原位雜交探針。
[0056] 其中，所述克隆引物對11-13如SEQIDNO. 21-26所示的堿基序列，包括：
[0063] 其中，所述通過克隆引物對11-13獲得目的基因片段的反應體系是
[0064] 反應物體積
[0065]PCRmix25U1
[0066]DNA模板IOOng
[0067]引物2yl
[0068] ddH20 余量
[0069] 總體積 50U1。
[0070] 其中，所述通過克隆引物對11-13獲得目的基因片段反應條件是：94°C預變性 lOmin，94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，30 個循環，72°C復性 7min，4°C保存。
[0071] 其中，所述將得到的基因片段連接到質粒中的反應體系是：T-vector0. 7y1，PCR 產物 5yI，T4 連接酶IyI，T4ByfferIyI，CldH2O余量，總體積 10y1。
[0072] 其中，所述將得到的基因片段連接到質粒中的反應條件是：在室溫條件下反應 2h〇
[0073] 其中，所述利用探針引物、熒光原料和所述質粒溶液制備具有熒光染料標記的熒 光原位雜交探針的反應體系為：
[0076] 其中，所述利用探針引物、熒光原料和所述質粒溶液制備具有熒光染料標記的熒 光原位雜交探針的反應條件為：94°(：預變性21^11，94°(：變性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸 458,30個循環，72°(：復性1〇111111，4°(：保存。得到熒光原位雜交探針。
[0077] 其中，所述熒光原位雜交探針的濃度是約8_20ng/ y 1。
[0078] 優選的，所述熒光原位雜交探針的濃度是約10_15ng/ y 1。
[0079] 其中，所述雜交反應的共變性溫度是70_80°C，共變性反應時間是5-10min。
[0080]優選地，所述雜交反應的共變性溫度是73-76°C，共變性反應時間是7-8min。
[0081] 其中，所述雜交反應的雜交溫度是40-46°C，雜交時間是14-18h。
[0082]優選地，所述雜交反應的雜交溫度是42-44°C，雜交時間是16h。
[0083] 其中，所述VHL基因突變檢測還包括：
[0084] 采用VHL基因的三個外顯子VHL-UVHL-2和VHL-3的擴增引物對5-7對所述DNA 溶液進行VHL基因點突變、小片段缺失或插入、剪切位點突變的檢測，獲得所述DNA溶液中 是否存在點突變、小片段缺失或插入、剪切位點突變的檢測結果。
[0085] 其中，所述VHL基因的三個外顯子VHL-I、VHL-2和VHL-3的擴增引物對5-7如SEQ IDNO. 9-14所示，分別為：
[0092] 尤其是，所述采用VHL基因的三個外顯子VHL-1、VHL-2和VHL-3的擴增引物對所 述D