一種基于稀有細胞檢測her-2/cep17基因狀態的方法及相關試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學診斷學，特別涉及腫瘤細胞的檢測。更具體地講，本發明涉及檢測 癌癥和評估患者的治療方案的診斷方法。
【背景技術】
[0002] 循環腫瘤細胞（CirculatingTumorCell,CTC)指進入到血液循環中的腫瘤細胞， 其可由原發灶或轉移灶脫落入血，亦可能在形成實體瘤病灶之前進入血液中。腫瘤細胞侵 入循環系統，大部分由于機體的免疫識別、機械殺傷及自身凋亡在短期內死亡，只有極少數 存活下來，并在遠端或原發組織及器官種植，進一步發展為轉移灶，是導致腫瘤轉移和復發 的最直接因素。
[0003]CTC作為一種可以代表原發腫瘤的"液體活檢"樣本，外周血標本易獲取、創傷性 小、可反復采集，是臨床檢測更為理想的標本來源，可對腫瘤治療進行實時全面監測。可有 效實現腫瘤復發預警，療效及時評價以及腫瘤個體化治療用藥指導，目前CTC檢測已廣泛 運用于臨床腫瘤患者的療效實時評價、病情實時監測、耐藥析因、預后判斷中。
[0004]焚光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，FISH)是一種細胞遺傳學 技術，可以用來對核酸進行檢測和定位。目前基于脫落稀有細胞的FISH技術一般為定性檢 測，很難做到精準定量且保證其效果。究其根本原位在于目前適用于組織標本的FISH檢測 方法及普通的脫落細胞學FISH檢測方法，當數量級在0-100間的細胞涂片后，無法在著色 效果和有效保持細胞方面取得較好的平衡并保持較高的穩定性，更難以形成有效穩定定量 檢測的成型產品。目前雖有相應專利闡述一種有效方法（US6, 524, 798)，但需極其高昂成 本的專用檢測設備，無法在常規實驗室完成這基于及少量稀有細胞、甚至是單細胞層面的 FISH檢測工作。
[0005] 此前已描述了來自生物樣品的腫瘤細胞、稀少細胞或其他生物實體的鑒定方法 (如中國專利【申請號】200810097889. 4、201310057307. 0)。此兩步法要求有效富集以確保 在分析之前獲取靶細胞，同時去除大量碎片和其他干擾物質，使得可通過成像技術進行細 胞檢驗。此方法以獨特的陰性富集策略將免疫磁微粒與多密度離心方式、熒光原位雜交和 免疫熒光細胞化學分析組合起來，精確定量地檢測幾乎所有實體腫瘤類型中脫落至含血 液、胸/腹腔積液、尿液、腦脊液等多種生物體液標本中的稀有細胞（含CTC)。此組合方法 用于富集和計數血樣中的染色體擴增型腫瘤細胞，因此提供了一種量度癌癥的工具。
[0006] 原癌基因人類表皮生長因子受體2(HER-2)基因，即c-erbB-2基因，定位于染色 體17ql2_21. 32上，編碼相對分子質量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性。 目前基于HER-2基因的檢測，廣泛應用于乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的預后分析，尤其是基于 HER-2靶點的曲妥珠單抗（商品名：Here印tin)藥物的臨床應用方面。
[0007]《乳腺癌HER-2檢測指南》中指出乳腺癌HER-2檢測方法及報告推薦用兩種方法檢 測乳腺癌HER-2,即檢測蛋白的免疫組化法（IHC)和檢測基因的熒光原位雜交（FISH)法，該 指南建議，ffiR-2檢測FISH報告主要包括：所計數的浸潤癌細胞數量、平均每個細胞核中HER-2信號數量、平均每個細胞核中CEP17信號數量、平均每個細胞核中HER-2和CEP17信 號數量的比值。
[0008] 但是臨床檢測時，會由于例如已手術切除、患者主觀意愿不脅從等諸多無法有效 獲得腫瘤組織的情況，而存在以下局限性：
[0009] 1、作為有創性且受限于病灶位置的組織學檢測，存在標本取材不易或無法取材等 局限性，且術后不能反復取材，導致組織取材無法提供實時性的監測信息。
[0010] 2、且受治療的影響等，腫瘤細胞的分子信息有可能發生動態改變。如：有研究報 道，接受新輔助化療的乳腺癌患者，在化療前接受活檢，并將結果與術后病理進行對照，發 現存在治療前后ffiR-2表達不一致的情況。
[0011] 3、腫瘤組織異質性的存在以及單點活檢造成的只是局部信息反映的現狀，使得傳 統組織學檢測缺乏全面整體性的評價，如原發灶、多發轉移灶信息的綜合評價等。
[0012] 本發明在于提供了一種檢測CTC或其他稀有細胞的同時對HER-2/CEP17的數量及 比值進行檢測的方法。以獲得更加全面的信息。本發明在分離獲取血液中CTC(或其他稀 有細胞）的基礎上，進行單細胞分子分析，檢測ffiR-2表達情況，以此來從單細胞水平上，即 時地發現HER-2的分子信息，以便對患者的狀態進行實時觀察。
【發明內容】
[0013] 本發明提供一種檢測CTC或其他稀有細胞的同時對HER-2/CEP17的數量及比值進 行檢測的方法。直接幫助臨床醫師了解腫瘤患者實時的基因狀態，以輔助預測生存情況并 擬定下一步治療方案。本發明的方法包括以下全部及部分步驟：
[0014] 步驟1，從患者獲得血液樣本或其他含有稀有細胞的體液樣本，樣本中包含CTC或 其他稀有細胞與白細胞的混合細胞群；
[0015] 步驟2,用緩沖液稀釋樣本，離心去除血漿，并回收CTC或其他稀有細胞；
[0016] 步驟3,用紅細胞裂解液裂解，離心去除紅細胞并回收CTC或其他稀有細胞；
[0017] 步驟4,用包被有抗人白細胞相關抗原抗體的磁微粒同步驟3所得的回收細胞混 勻孵育，以使磁微粒同標的白細胞充分結合并形成磁微粒-白細胞混合體；
[0018] 步驟5,離心將磁微粒-白細胞混合體與其他細胞分離，得到含有CTC或其他稀有 細胞及少量白細胞的混合細胞群；
[0019] 步驟6,使用免疫熒光細胞化學與熒光原位雜交的相結合的方法，測定HER-2/ CEP17的狀態，同時進行CTC或其他稀有細胞的鑒別。
[0020] 本發明所述的方法，其中，步驟2所述緩沖液為一種與血液密度相近的緩沖液，含 有BSA、PBS等物質，pH7-8之間，能夠保證去除血漿的同時，保護各種有核細胞。
[0021] 本發明所述的方法，其中，步驟3所述紅細胞裂解液為一種紅細胞裂解液，利用等 滲不等張的原理，裂解紅細胞的同時，不會損傷其他有核細胞。
[0022] 如以下配方的裂解液：
[0023] NH4C1 82. 9g
[0024] KHC0310g
[0025] EDTAO. 37g
[0026] 加H20至1000ml(高壓滅菌，4°C保存）
[0027]或
[0028] 紅細胞裂解液（Tris-MMCl):稱取3. 735g氯化銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris)I. 3g 加水溶解并稀釋至500ml。0. 22ym濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0029] 本發明所述的方法，其中，步驟4所述包被有抗人白細胞相關抗原抗體的磁微粒 為一種包被抗白細胞共同抗原抗體的鏈親和素磁珠。能夠最大量地、牢固地結合白細胞，利 于后續的分選處理。
[0030] 本發明所述的方法，其中步驟5所述離心介質為一種密度介于1. 070-1. 080之間 的密度梯度離心液，其中以1. 072最優，可以在去除結合磁珠的白細胞的同時，保存其他單 個有核細胞不丟失。
[0031] 本發明所述的方法，其中，步驟6所述使用免疫熒光細胞化學與熒光原位雜交的 方法，對CTC或其他稀有細胞進行CTC鑒別，同時測定HER-2/CEP17,方法如下：
[0032] (l)HER-2擴增型CTC:將標本置于熒光顯微鏡相應通道下觀察，若發現多個HER-2 信號點分布（彡3個），且數目大于CEP17的信號點數，并且無⑶45抗原表達，則計為一個 CTC陽性細胞，且直接視該細胞為HER-2陽性細胞；
[0033] (2)染色體擴增型CTC:計數單個有核細胞CEP17信號數目，若大于等于3個信號 點且無⑶45抗原表達，則計為一個CTC陽性細胞；
[0034] (3)HER-2/CEP17-CTC總數目：記錄所有HER-2擴增型及染色體擴增型CTC數目， 總和視為HER-2/CEP17-CTC總數目；
[0035] (4)HER-2基因擴增狀態記錄：在所有標本區域中若有明顯且典型HER-2擴增，則 記為HER-2擴增；若無，則將所有CTC細胞內平均每個細胞核中HER-2信號數量、平均每個 細胞核中CEP17信號數量、平均每個細胞核中HER-2和CEP17信號比值的結果。
[0036] -種用于上述方法的試劑盒一，包括如下成分：
[0037]
[0038]
[0039] 其中，IOX、20X表示濃度，即該溶液為10倍/20倍的濃度。
[0040] 本發明所述的試劑盒制備方法如下：
[0041] 試劑盒一包含下述富集及鑒別兩部分的試劑。
[0042] 富集部分：
[0043] CSl濃縮緩沖液（IOX):
[0044] 每1000 mL水中，含有 60gBSA，5 包PBS粉末（2L/ 包），IOOmL0? 5M的EDTA，0? 8mL Proclin300。
[0045] CS2濃縮儲存液（IOX):
[0046]每1000 mL水中，稱取 82. 9gNH4Cl、10gKHC03、0. 37gEDTA，水以及 0? 8mL Proclin300,進行充分的攪拌溶解，定容，配制為IOX濃縮液。
[0047]CS3分離介質：
[0048] 將密度為1. 077的梯度離心液稀釋，稀釋過程中測試密度，使其密度在 1. 070-1. 075 之間。
[0049] 磁微粒混懸液：
[0050] 將⑶45抗體濃度調整為lmg/mL，與鏈親和素免疫磁珠按照IOOuL:ImL的比例進行 孵育lh，即配制為磁微粒混懸液。
[0051] 鑒別部分：
[0052] CFl固定液：
[0053] 混合PEG和無水乙醇，使PEG終濃度為1 %，無水乙醇終濃度為50 %。
[0054] 10XCF2 固定液：
[0055] 以PBS為溶劑，溶解PFA粉末，配制為5 %的PFA濃縮液。
[0056] 甲酰胺工作液：
[0057] 將甲酰胺原液稀釋為50%的工作液。
[0058] 20XSSC濃縮緩沖液：
[0059]1000 mL水中，加入氯化鈉175. 3g，檸檬酸銨88. 2g。
[0060]HER-