一種無創檢測胎兒耳聾致病基因突變的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因診斷領域。更具體地，本發明涉及一種無創檢測胎兒耳聾致病基 因突變的方法。本發明還涉及用于檢測胎兒耳聾致病基因突變的試劑盒和用途。
【背景技術】
[0002] 耳聾是造成人類殘疾和影響人類健康的常見疾病，也是臨床上最常見的遺傳 性疾病之一。據統計，全世界每1000名新生兒中，有1例聽力障礙兒童（steelKP.New interventionsinhearingimpairment[J].BMJ，2000, 320 (4) :622 ~625)。造成耳聾有多 方面的原因，遺傳因素是最主要的。在出生時或3歲前就出現聽力喪失稱為學語前聽力缺 損，其中至少一半是遺傳缺陷所導致的。在大量遲發性聽力下降患者中，許多患者因自身基 因缺陷而致病，或因基因缺陷和多態性造成對環境因素的易感性增加而致病。據估計，全世 界非綜合征型遺傳性耳聾基因總數在100多個，結合國內的研究進展，我國被發現的耳聾 致病位點大部分集中在GJB2,GJB3,SLC26A4和線粒體12SrRNA上。
[0003] 為方便理解，下面對GJB2、GJB3和SLC26A4進行簡要介紹。GJB2基因：該基因定 位于常染色體13qll-12區域，DNA全長4804bp，含2個外顯子，編碼區為678bp，編碼由266 個氨基酸殘基組成的縫隙連接蛋白Connexin26,屬于(6-2蛋白，是鉀離子循環通路的一部 分。GJB2基因突變為遺傳性耳聾最常見的病因，GJB2基因突變導致的耳聾為語前、雙側、 對稱性耳聾，聽力損失程度變異較大，可由輕度到極重度，但多數為重度或極重度耳聾。在 中國人群中，常見GJB2基因突變類型主要有235delC、299-300delAT、176-191dell6等，可 占GJB2基因突變人群的80%以上。GJB3基因：該基因定位在常染色體lq33-35區域，有2 個外顯子，編碼含有270個氨基酸的縫隙連接蛋白C〇nnexin31。GJB3基因突變可引起常染 色體顯性或隱性遺傳性非綜合征性耳聾，被認為與高頻聽力下降有關。SLC26A4基因定位 于常染色體7q31區域，含21個外顯子，編碼1個由780個氨基酸殘基組成的多次跨膜蛋白 Pendrin，屬于離子轉運體家族，主要與碘/氯離子轉運有關，在機體離子成分平衡的維持 中發揮重要作用。近年來國外的多項研究表明SLC26A4基因突變與Pendred綜合征（PDS) (前庭水管擴大或伴內耳畸形神經性聾和甲狀腺腫）和大前庭水管綜合征（LVAS)有密切的 關系。在眾多的突變中，多數突變既見于pendred綜合征，又見于大前庭水管綜合征。因此， 同一位點的突變可能導致不同的臨床表現。SLC26A4基因突變種類較多，但281C>T、589G >A.IVS7-2A>GU174A>T(N392Y)U226G>AU229C>T(T410M)U975G>C.2027T> A(L676Q)、2168A>G(HIS723ARG)和IVS15+5G>A突變體頻率高達 82. 51%。
[0004] 隨著科技的進步，通過Sanger測序、基因芯片和蛋白檢測方法，許多新生嬰兒的 耳聾患者被診斷出來，在產前也有基于有創診斷胎兒耳聾致病基因的檢測，但是無創胎兒 耳聾致病基因的檢測還沒有人能夠實現。
[0005] 發明簡述
[0006] 發明人探索了一種基于第二代高通量測序技術，利用孕婦的靜脈血的片段DNA檢 測胎兒耳聾致病基因的基因突變（基因型）的方法。自從母體血液中的胚胎DNA被發現 之后，無創傷地直接診斷和檢測胚胎染色體異常性和基因突變成為可能（LoYM等，（1997)PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet, 350 :485-487) 〇第二代高通 量測序技術中，以Illumina產品為最優，其中兩個代表性的產品MiSeq和HiSeq，一個以測 序長度見長，另一個以測序通量見長，本發明利用MiSeq測序儀。但是，血液中胚胎DNA的 含量低，如何快速和準確的確定胎兒的相關基因型，仍然是需要解決的技術問題。
[0007] 本發明需要解決的技術問題是如何利用孕婦的靜脈血無創檢測胎兒的耳聾致病 基因的基因型。為此，本發明的第一個目的在于提出一種能夠通過血漿DNA樣品有效檢測 胎兒中耳聾致病基因預定突變位點的基因突變的方法，包括以下步驟：
[0008]a)針對耳聾致病基因預定突變位點設計引物；
[0009]b)提取孕婦的血漿DNA;
[0010] c)將所述提取的血漿DNA與預擴增接頭連接，獲得連接產物；
[0011]d)對所述連接產物進行PCR預擴增，獲得預擴增產物；
[0012] e)對所述預擴增產物進行環化，獲得環化DNA分子；
[0013]f)利用所述引物對所述環化DNA分子進行PCR擴增，獲得擴增產物；和 [0014]g)對所述擴增產物進行高通量測序并分析胎兒耳聾致病基因的突變。
[0015] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述預定位點的突變選自GJB2基因、GJB3基 因和SLC26A4基因的22個位點的至少一種基因的突變。
[0016] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述引物是一對背靠背的引物對。
[0017] 根據本發明的另一個優選的實施方式，所述背靠背的引物對針對GJB2外顯子2、 GJB3外顯子2、SLC26A4外顯子3、SLC26A4外顯子5、SLC26A4外顯子7、SLC26A4內含子7、 SLC26A4外顯子8、SLC26A4外顯子10、SLC26A4外顯子17或SLC26A4外顯子19而設計。
[0018] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述背靠背引物對由一組疾病檢測點（即高 頻突變點）附近的背靠背引物組成。
[0019] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述背靠背引物對帶有適用于不同高通量測 序平臺的通用引物區。
[0020] 根據本發明的又一個優選的實施方式，所述背靠背引物對的序列分別為：
[0034]PDSlO-R(SEQIDNO：20) ：CAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATG
[0035]PDS17-F(SEQIDNO:22):TTCCTGGACGTTGTTGGAG
[0036]PDS17-R(SEQIDNO:23):GATATAGCTCCACAGTCAAGCAC
[0037]PDS19-F(SEQIDNO:25):TCTTGAGATTTCACTTGGTT
[0038]PDS19-R(SEQIDNO:26) :GTTCCATTTTAGAAACGGTA。
[0039] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述背靠背引物對中的一對引物檢測一個或 多個位點。
[0040] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述GJB2基因、GJB3基因和SLC26A4基因的 22個位點的檢測利用9對引物的一次PCR完成。
[0041] 根據本發明的一個特別優選的實施方式，所述接頭為barcode(多序列標記）接 頭。
[0042] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述接頭之間至少有兩個堿基差異。
[0043] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述接頭是部分配對的Y型接頭。
[0044] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述步驟e)的環化所使用的方法為夾板式 環化，以與預擴增產物的DNA兩端互補的單鏈DNA為夾板，由耐熱Taq連接酶完成環閉合。
[0045] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述步驟e)的環化為單體系循環多次反應， 所述循環由DNA變性、夾板DNA退火和連接組成。
[0046] 根據本發明的一個優選的實施方式，本發明所述方法進一步包括消化未環化的線 性DNA分子。
[0047] 根據本發明的一個優選的實施方式，本發明方法在于利用孕婦的靜脈血的片段 DNA檢測胎兒耳聾致病基因的基因型。
[0048] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述耳聾致病基因具有插入、缺失、替換或基 因融合突變。
[0049] 本發明的第二個目的在于提供一種無創檢測胎兒耳聾致病基因突變的試劑盒，包 含：
[0050] 提取血漿DNA的試劑、DNA環化酶、目標DNA擴增引物和擴增試劑。
[0051] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述試劑盒進一步包括耳聾致病基因預定位 點預擴增引物及預擴增試劑。
[0052] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述試劑盒進一步包括用于高通量測序的試 劑。
[0053] 根據本發明的一個優選的實施方式，所述血漿DNA與接頭連接，所述接頭為 barcode(多序列標記）接頭。
[0054] 本發明的第三個目的在于提供針對耳聾致病基因預定位點的突變設計的引物在 制備用于無創檢測胎兒耳聾致病基因突變的診斷試劑或試劑盒中的用途，其特征在于，所 述診斷試劑或試劑盒適用于包括以下步驟的無創檢測胎兒耳聾致病基因突變的方法：
[0055]a)針對耳聾致病基因預定位點的突變設計引物；
[0056]b)提取孕婦的血漿DNA;
[0057]c)將所述提取的血漿DNA與預擴增接頭連接，獲得連接產物；
[0058] d)對所述連接產物進行PCR預擴增，獲得預擴增產物；
[0059]e)對所述預擴增產物進行環化，獲得環化DNA分子；