一種微生物生產(s)-硝基苯乙醇的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到黃藍狀菌細胞生物催化制備手性醫 藥中間體（S)-1-(4-硝基苯）乙醇的技術。
【背景技術】
[0002] 手性（S)-l_(4-硝基苯）乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品和其他特殊 材料的重要中間體。生物催化不對稱反應具有環境友好、條件溫和、選擇性高等優點，作為 綠色高效制備手性化合物的優先途徑，被越來越多地應用于生產一些高附加值的手性化 合物。生物催化制備手性（S)-l_(4-硝基苯）乙醇具有很好的應用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環境友好等突出優點，是可持續 發展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產品，在工業生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業上的應用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業制備光學活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004] 生物還原法相對于動力學拆分法而言，最大的優勢在于理論收率可達100%，原子 經濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑，實現體內輔酶循環再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)-l_(4_硝基苯）乙醇是合成手性藥物、精細化學品、農藥品的重要手性砌 塊，。現有的方法普遍存在轉化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺陷， 難于進行工業化生產。本發明將采用生物細胞催化制備（S)-l-(4-硝基苯）乙醇。
【發明內容】
[0006] 本發明采用黃藍狀菌細胞催化制備（S)-1-(4-硝基苯）乙醇，反應式如下：
對硝基苯乙酮（1)經黃藍狀菌催化反應，得到產物（S)-l_(4-硝基苯）乙醇（2)。有 多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用黃藍狀菌作為催化劑，因為 其催化反應的效果最好，反應收率、對映體過量率（ee%)均很高。
[0007] 許多黃藍狀菌都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經實驗， 本發明選用黃藍狀菌菌株為ATCC52267，其催化反應效果最佳。
[0008] 由于絕大多數氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型，而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進行氧化還原反應時，為促進輔酶再生，提高反應效率，在反應體系中 還添加輔助底物構成轉化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發明經過大量實驗確定的輔助底物為：蔗糖25-28g/L、異丙醇7-8%V/V(體 積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養介質： 1、種子培養基成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀I. 8-2. 3g/L;配制 固體培養基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養液成份：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，黃豆粉3-4g/L，酵母浸 膏 8-10g/L，葡萄糖 18-22g/L，麥芽浸膏 20-25g，硫酸銨 0.5-0. 7g/L，硫酸鎂 0.3-0. 4g/ L，磷酸二氧鉀1.8-2. 3g/L，碳酸鈣0.7g/L，硫酸亞鐵0.18g/L，硫酸錳0.025g/L;pH 4. 0〇
[0012] 2、固體培養基成份：在液體培養基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 黃藍狀菌細胞制備。黃藍狀菌經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加入 培養液，121°c高壓滅菌30分鐘，冷卻至26-27°C，將黃藍狀菌種子液接種至發酵罐，接種 比例為9-10%，通氣比為0.9-1￥八￥分鐘），26-27°(：培養41-45小時，用過濾式離心機離心 得到濕黃藍狀菌細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0014] 生物催化轉化。底部通氣攪拌反應罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為5.0,加入底物 對硝基苯乙酮，使底物濃度為80-90g/L。其他成份：玉米漿（以干物質計）含量為19-20g/ L，支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚7-9g/L，蔗糖25-28g/L、異丙醇7-8%V/V(體積濃 度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至30-31°C時，加入濕黃藍狀菌細胞使其濃度為62-66g/ L，通氣比為0. 1-0. 12V/(V分鐘)，進行生物催化反應，反應時間為58-62小時；反應結束后， 濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產物（S)-l_(4-硝基苯）乙醇，反 應轉化率98-99 %，產品收率96-97 %，對映體過量率98. 5-99 %。
[0015] 本發明所開展工作包括菌株選擇、催化反應條件優化(反應溫度、通氣量、pH)、反 應介質選擇和濃度優化，包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類及濃度等。
[0016] 實施例1 種子培養基成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀I. 8-2. 3g/L;配制固體 培養基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 培養液成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，黃豆粉3-4g/L，酵母浸 膏 8-10g/L，葡萄糖 18-22g/L，麥芽浸膏 20-25g，硫酸銨 0.5-0. 7g/L，硫酸鎂 0.3-0. 4g/ L，磷酸二氧鉀1.8-2. 3g/L，碳酸鈣0.7g/L，硫酸亞鐵0.18g/L，硫酸錳0.025g/L;pH 4. 0〇
[0018] 濕黃藍狀菌細胞制備過程如下：黃藍狀菌ATCC52267經斜面、搖瓶培養，得到種 子液。IL發酵罐加入培養液；發酵罐加入培養液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至26-27°C， 將黃藍狀菌種子液接種至發酵罐，接種比例為接種比例為9-10%，通氣比為0. 9-1V/ (V分 鐘)，26-27°C培養41-45小時，用過濾式離心機離心得到濕黃藍狀菌細胞，用作生物催化反 應催化劑。
[0019] 生物催化轉化：0. 5L底部通氣攪拌反應器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為5. 0,加 入底物對硝基苯乙酮，使其濃度為80g/L，玉米漿（以干物質計）含量為20g/L，支鏈化 13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚7-9g/L，蔗糖25-28g/L、異丙醇7-8%V/V(體積濃度），121°C 高壓滅菌30分鐘；冷卻至31°C時，加入濕黃藍狀菌細胞使其濃度為62-66g/L，通氣比為 0. 1-0. 12V/(V分鐘)，進行生物催化反應，反應時間為58-62小時；反應結束后，濾出細胞， 用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產物（S)-l-(4-硝基苯）乙醇，反應轉化率 99%，產品收率97%，對映體過量率98. 5%。
[0020] 實施例2 種子培養基成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，酵母提取物10g/L，葡 萄糖20g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀I. 8-2. 3g/L;配制固體 培養基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0021] 培養液成份為：玉米漿（以干物質計）含量為35-45g/L，黃豆粉3-4g