一種細胞生產(s)-羥乙基苯甲磺酸酯的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于制藥工程技術領域，特別涉及到挪威假絲酵母細胞生物催化制備手 性醫藥中間體（S)-4-(l-羥乙基）苯甲磺酸酯的技術。
【背景技術】
[0002] 手性⑶-4-(1-羥乙基）苯甲磺酸酯是合成手性藥物、精細化學品、農藥品和其 他特殊材料的重要中間體。生物催化不對稱反應具有環境友好、條件溫和、選擇性高等優 點，作為綠色高效制備手性化合物的優先途徑，被越來越多地應用于生產一些高附加值的 手性化合物。生物催化制備手性（S)-4_(l-羥乙基）苯甲磺酸酯具有很好的應用前景。
[0003]生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環境友好等突出優點，是可持續 發展過程中替代和拓展傳統有機化學合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應用領域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學拆 分外消旋體得到手性產品，在工業生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業上的應用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業制備光學活性手性化合物的比例為4: 2:1。
[0004]生物還原法相對于動力學拆分法而言，最大的優勢在于理論收率可達100%，原子 經濟性好。然而生物還原反應需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應中多釆用整細胞作為催化劑，實現體內輔酶循環再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)-4_(l-羥乙基）苯甲磺酸酯是合成手性藥物、精細化學品、農藥品的重要手 性砌塊，。現有的方法普遍存在轉化率低、反應時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴重缺 陷，難于進行工業化生產。本發明將采用生物細胞催化制備（S)-4_(l-羥乙基）苯甲磺酸 酯落。
【發明內容】
[0006]本發明采用挪威假絲酵母細胞催化制備（s)-4_(l-羥乙基）苯甲磺酸酯，反應 式如下：
對苯丙酮甲磺酸酯（1)經挪威假絲酵母催化反應，得到產物（S)-4-(l-羥乙基）苯甲 磺酸酯（2)。有多種微生物可以催化此反應，經過大量實驗篩選，最終確定采用挪威假絲酵 母作為催化劑，因為其催化反應的效果最好，反應收率、對映體過量率（ee%)均很高。
[0007] 許多挪威假絲酵母都可以進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經 實驗，本發明選用挪威假絲酵母菌株為ATCC60365，其催化反應效果最佳。
[0008] 由于絕大多數氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型，而細胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進行氧化還原反應時，為促進輔酶再生，提高反應效率，在反應體系中 還添加輔助底物構成轉化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發明經過大量實驗確定的輔助底物為：木糖20-24g/L、麥芽糖12-15g/L、異 丙醇8-10%V/V(體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養介質： 1、 種子培養基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH自然； 配制固體培養基時添加15g/L的瓊脂粉； 2、 培養液成份：葡萄糖25-30g/L，甘油25-30g/L，玉米胚芽粉30-40g/L，KH2P04 9-11g/L，MgS04. 7H20 0? 3-0. 4g/L，pH值為 6. 0。
[0011] 2、固體培養基成份：在液體培養基中加入2%的瓊脂粉。
[0012] 1酵母細胞制備。挪威假絲酵母經斜面、搖瓶、種子罐培養得到種子液；發酵罐加 入培養液，發酵罐加入培養液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至30-31°C，將挪威假絲酵母 種子液接種至發酵罐，接種比例為6-6. 5%，通氣比為0. 6-0. 8V/ (V分鐘），30-31°C培養 47-50小時，用過濾式離心機離心得到濕酵母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0013] 生物催化轉化。底部通氣攪拌反應罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 4,加入底物 對苯丙酮甲磺酸酯，使底物濃度為80-90g/L。其他成份：葡萄糖26-30g/L，吐溫80 6-8g/ L，木糖20-24g/L、麥芽糖12-15g/L、異丙醇8-10%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分 鐘；冷卻至30-31°C時，加入濕酵母細胞使濃度為89-92g/L，通氣比為0. 11-0. 13V/ (V分 鐘)，即每分鐘通氣量為0. 11-0. 13倍反應液體積，進行生物催化反應，反應時間為69-72小 時；反應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產物（S)-4-(l-羥 乙基）苯甲磺酸酯，反應轉化率98-99%，產品收率96-97%，對映體過量率98. 5-99%。
[0014] 本發明所開展工作包括菌株選擇、催化反應條件優化(反應溫度、通氣量、pH)、反 應介質選擇和濃度優化，包括底物濃度、麥芽浸膏含量、輔助底物組合、表面活性劑種類及 濃度等。
[0015] 實施例1 種子培養基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH自然；配 制固體培養基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0016] 培養液成份為：葡萄糖25-30g/L，甘油25-30g/L，玉米胚芽粉30-40g/L， KH2P04 9-11g/L，MgS04. 7H20 0? 3-0. 4g/L，pH值為 6. 0。
[0017] 濕酵母細胞制備過程如下：挪威假絲酵母ATCC60365經斜面、搖瓶培養，得到種 子液。IL發酵罐加入培養液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至30°C，將挪威假絲酵母種子 液接種至發酵罐，接種比例為6%，通氣比為0. 6-0. 8VAV分鐘），30°C培養47小時，用過濾 式離心機離心得到濕酵母細胞，用作生物催化反應催化劑。
[0018] 生物催化轉化：0. 5L底部通氣攪拌反應器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 4,加入 底物對苯丙酮甲磺酸酯，使濃度為80g/L，葡萄糖26g/L，吐溫80 8g/L，木糖20g/L、麥芽糖 15g/L、異丙醇8%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至30°C時，加入濕酵母細 胞使濃度為89g/L，通氣比為0.IlV/ (V分鐘)，進行生物催化反應，反應時間為69小時；反 應結束后，濾出細胞，用乙酸乙酯萃取反應液，蒸出乙酸乙酯，得到產物（S)-4-(l-羥乙基） 苯甲磺酸酯，反應轉化率99 %，產品收率97 %，對映體過量率98. 5 %。
[0019]