表面活性劑包衣菌體催化合成共軛亞油酸異構體的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002]共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一組十八碳共軛二稀酸的統稱，共軛雙鍵有4種位置異構(8，10; 9, 11; 10, 12; 11，13)和4種幾何異構(cis，cis;cis, trans] trans, cis\ trans, trans),共有多達 16 種異構體，如:c9, ill-CLA 和ilO, C12-CLA異構體等。研究發現CLA具有抗癌、預防動脈粥樣硬化、增強機體免疫力、抗糖尿病等生理功能，且越來越多的研究表明其生理活性具有異構體特異性，現在普遍認為d，1-CLA異構體具有抗癌和預防動脈粥樣硬化的作用。在自然界中，CLA主要存在于反芻動物的奶和肉中的脂肪中，主要由說ill-CLA和少量份’ ill-CLA, ilO，cll-CLA等異構體構成，但其含量通常都小于10mg/g脂肪，無法滿足以保健和醫療為目的的開發應用。
[0003]為實現CLA異構體的大量制備，人們已對微生物發酵制備CLA進行了較多研究。目前，微生物發酵均在水溶液中進行，由于所加的發酵底物一亞油酸是脂溶性物質，因此亞油酸加入發酵液前需經乳化處理，且添加量受到限制，從發酵液中獲得CLA產物需經有機溶劑萃取，整個生產工藝存在發酵周期長、生產成本高、產量低的缺點。發明專利CN201110105610提出了一種植物乳桿菌生物轉化共軛亞油酸的方法，底物添加量為25mg/mL，發酵時間長達120h，CLA的產量只有1.02mg/mL，底物的轉化率只有4%。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術的不足，提出一種表面活性劑包衣菌體催化合成共軛亞油酸異構體的方法，顯著縮短合成時間、提高產量和轉化率、降低生產成本。
[0005]本發明包括以下步驟。
[0006](I)菌體的透性化處理:收集處于對數生長期的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei ) CGMCC 1.574菌體，按每克濕菌體重懸于5mL透性化處理液中計，將濕菌體重懸于透性化處理液中(所述的透性化處理液含體積百分比0.5-3.0%的曲拉通X-100，20-200mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液)，重懸菌體經37°C處理20min，離心收集透性化菌體。
[0007](2)菌體包衣處理:透性化菌體用60mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液洗滌后，離心收集菌體，按每克濕菌體重懸于20mL60mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液中計，將透性化濕菌體重懸于磷酸鹽緩沖液中，再向其中滴加表面活性劑溶液(所述的表面活性劑溶液為含質量百分比1%谷氨酸雙油醇酯核糖醇的丙酮溶液)，邊加邊混合均勻，于4-40°C處理2-6h，離心收集菌體，將菌體冷凍干燥后得到包衣菌體。
[0008](3)催化合成:按每克凍干包衣菌體加入到500mL正己烷中計，將包衣菌體加入到正己烷中，攪拌均勻，加入正己烷體積百分比0.1-0.3%的亞油酸，在4-40°C下反應l_12h。
[0009](4)產物收集:離心分離包衣菌體，將正己烷溶液進行減壓蒸餾，回收正己烷，產物為c9, ill-共軛亞油酸異構體。
[0010]本發明所述的步驟(I)中透性化處理液優選為含體積百分比1.0-2.0%的曲拉通X-100，30-100mM、pH5.8的磷酸鹽緩沖液。
[0011]本發明所述的步驟(2)中表面活性劑溶液的滴加量優選為每50mL菌懸液加入5-15mL表面活性劑溶液。
[0012]本發明所述的步驟(2)中處理溫度優選為4_25°C。
[0013]本發明所述的步驟(2)中處理時間優選為3_5h。
[0014]本發明所述的步驟(3)中優選加入正己烷體積百分比0.125-0.25%的亞油酸，在15-30 °C 下反應 2-6h。
[0015]本發明所述的步驟(4)中包衣菌體可重復用于催化合成d，ill-共軛亞油酸異構體。
[0016]本發明所用的干酪乳桿菌(Zac1AaciWiAs casei) CGMCC 1.574，系中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏菌株，編號為1.574，該菌株能產生特異性的亞油酸異構酶，通過生物異構化可將亞油酸轉化成d，ill-CLA異構體。目前，還沒有分離到有確切催化活性的亞油酸異構酶純品。因此，該異構化反應可能是由多酶體系共同催化完成。
[0017]通過該包衣菌體在有機介質中催化合成方法，在優化條件下，含體積百分比0.15%亞油酸的正己烷溶液反應后所合成說ill-CLA異構體的含量為體積百分比0.139%，亞油酸的轉化率為92.7%。本發明所述的步驟(4)中包衣菌體可重復用于步驟(3)的催化合成c9, 1-CLA異構體，包衣菌體重復使用五次后，其催化活性仍大于90%。
[0018]針對現有微生物發酵合成CLA均在水溶液中進行，整個生產工藝存在發酵周期長，從發酵液中提取CLA產物困難，菌體不能重復使用，生產成本高，產量低等諸多缺點。本發明提出了通過微生物菌體在有機介質中將亞油酸催化合成d，ill-CLA的新方法。該方法首先通過曲拉通X-100處理干酪乳桿菌CGMCC 1.574，在保持菌體完整性的同時，提高菌體細胞壁和細胞膜的通透性，一方面可以確保在后續包衣處理時細胞內的亞油酸異構酶表面能形成完整包衣層，另一方面可以提高反應底物亞油酸和產物CLA進出菌體的速率，減少高濃度底物和產物對催化反應的抑制作用，大大縮短反應時間。
[0019]本發明選用谷氨酸雙油醇酯核糖醇對菌體進行包衣，谷氨酸雙油醇酯核糖醇分子中含有2個油醇基團，油醇和亞油酸結構相似，是菌體中亞油酸異構酶底物的結構類似物，在菌體包衣時，能在酶的催化活性中心形成分子印跡，使菌體在冷凍干燥后酶的催化活性中心構象不變，能在有機溶劑中保持較高的催化活性。同時，本發明結合在菌體包衣處理過程中選用合適的磷酸鹽緩沖液、谷氨酸雙油醇酯核糖醇濃度和包衣溫度、時間，使所得包衣菌體在有機介質中仍具有較高的催化能力。包衣后菌體中酶的熱穩定性提高，每批次反應時間僅需4h，遠小于傳統水溶液中批次發酵所需的數天時間。
[0020]本發明所得包衣菌體在正己烷中有較高催化活性，只需離心分離包衣菌體，將正己烷溶液進行減壓蒸餾，回收正己烷，即可得到產物d，ill-CLA。離心所得包衣菌體可多次重復用于有機介質中生物合成d，ill-CLA異構體，顯著縮短了生產時間，提高了產量，降低了生產成本。此外，正己烷是食用油脂工業常用的有機溶劑，這也保證了本發明所得c9, il 1-CLA的使用安全性。
[0021]本發明與現有技術相比具有如下優點。
[0022]本發明直接對菌體進行包衣處理，作為固定化酶用于催化反應，一方面減少了酶分離純化的成本，避免了酶在提取時活性的損失；另一方面可以將多酶體系包在一起，使整個反應過程得以順利進行；再者包衣菌體顆粒大于包衣酶，易于從反應溶液中分離出來，且過濾阻力較小，因此，包衣菌體更加適合用于連續反應的柱式反應器。
[0023]本發明通過包衣菌體在有機介質中進行催化反應，避免了在傳統水溶液反應體系中底物亞油酸溶解度低和產物CLA提取困難的問題。包衣菌體中酶的熱穩定性提高，每批次反應時間僅需4h，遠小于傳統水溶液中發酵所需的數天時間。包衣菌體可重復使用多次，顯著提高產品產量，且無環境污染，可顯著降低生產成本；而傳統水溶液體系發酵液中的菌體只能使用一次，生產成本高，且發酵廢液處理費用高，易污染環境。
【具體實施方式】
[0024]本發明通過以下實施例作進一步地說明。
[0025]實施例1。
[0026]將活化的干酪乳桿菌QLactobacillus casei) CGMCC 1.574菌種接種到MRS培養基中，于30°C下培養20h，5000g離心1min收集菌體，將10克濕菌體重懸于50mL含體積百分比1.5%的曲拉通X-100和50mM磷酸鹽緩沖液(pH5.8)的透性化處理液中，37°C水浴處理20min，5000g離心1min得到透性化菌體。
[0027]透性化菌體用50mL60mM磷酸鹽緩沖液(pH5.8)洗滌后，6000g離心1min收集菌體，將濕菌體重懸于200mL60