一種枯草芽孢桿菌發酵生產2,3-丁二醇的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及利用一種枯草芽孢桿菌發酵生產2，3-丁二醇的方法。
【背景技術】
[0002]2，3-丁二醇是一個重要的生物基四碳平臺化合物，廣泛應用于化工、食品、醫藥、燃料及航空航天等多個領域。2，3- 丁二醇經脫水反應可以生產1，3- 丁二烯，I, 3- 丁二烯可用于合成橡膠、ABS樹脂及SBS彈性體等。由于2，3- 丁二醇冰點低達_60°C，因此可以用作抗凍劑。2，3- 丁二醇還可以通過脫氫反應生成3-羥基丁酮和雙乙酰，它們具有令人愉快的乳香香味，是食品工業中常用的調香劑。2，3-丁二醇脫氫還可以生產甲基乙基酮，它是一種燃料添加劑，燃燒值比乙醇還要高，同時甲基乙基酮還可以用作樹脂和涂料的溶劑。2，3-丁二醇燃燒熱值達到27198J/g，和乙醇(29055J/g)相當，并且具有較高的辛烷值，是一種潛在的高價值航空燃料添加劑。
[0003]2，3- 丁二醇生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法兩大類，化學法主要是在高溫、高壓條件下，將石油裂解時得到的四碳類碳氫化合物水解產生2，3-丁二醇，工藝條件要求高，隨著石油資源的日益消耗和環境問題的惡化，這種化學合成工藝將逐漸被淘汰。微生物發酵法生產2，3-丁二醇由于其原料來源方便、操作工藝簡單、環境友好等一系列優點，已引起人們的廣泛關注。目前，已經報道的產2，3-丁二醇菌株主要集中在Klebsiella、Enterobacter、Serratia、Bacillus 等菌屬的菌株(Ji XJ et al.Microbial2,3-butaned1l product1n:A state-of-the-art review.B1technology Advances29 (2011): 351 - 364)，其中產率較高的菌種是 Klebsiella pneumoniae、Klebsiellaoxytoca、Serratia marcescens，但這兩類菌都是條件致病菌，不宜工業化推廣。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是公認的安全性菌株，是工業發酵中常用生產菌株。利用枯草芽孢桿菌生產2，3- 丁二醇也有報道(饒志明等，一株環境安全的以葡萄糖為底物產2，3- 丁二醇枯草芽抱桿菌的選育，中國專利，CN101851598A, 2010 ；R.Biswas et al.Enhancedproduct1n of 2,3-butaned1l by engineered Bacillus subtilis.Appl Microb1lB1technol (2012)94:651 - 658)，但產率與 K.pneumoniae、S.marcescens 等菌株相比產率較低，沒有競爭優勢。提供高效安全的生產2，3- 丁二醇的菌株及發酵工藝，是本領域內技術人員面臨的主要問題。
【發明內容】
[0004]為解決現有技術存在的上述問題，本發明提供一種枯草芽孢桿菌發酵生產2，3-丁二醇的方法。
[0005]發明人曾經公開從自然環境中篩選到的一株產3-羥基丁酮生產菌株Bacillussubtilis SFA-H43(趙祥穎等.一株產3-羥基丁酮的芽孢桿菌及其應用.中國專利.CN103333842B, 2015)，利用該菌株發酵生產3-羥基丁酮，當發酵液中的葡萄糖濃度耗盡后繼續培養3-羥基丁酮的產率會增加10-20%。在此基礎上，發明人進一步的研究發現，菌株SFA-H43在利用葡萄糖進行發酵3-羥基丁酮的過程中，同時伴有2，3- 丁二醇產生，2，3- 丁二醇和3-羥基丁酮可以相互轉化，發酵前期產物以2，3- 丁二醇的為主，發酵后期2，3- 丁二醇逆轉化為3-羥基丁酮，當發酵液中葡萄糖耗盡后，2，3-丁二醇仍可繼續轉化生成3-羥基丁酮，使3-羥基丁酮產率繼續增加(見附圖1)。此外，發明人通過對發酵培養基及發酵過程的工藝參數的調整，實現了利用菌株SFA-H43轉化葡萄糖大量積累2，3- 丁二醇的結果O
[0006]本發明的目的之一是提供一種枯草芽孢桿菌CCTCC No:M 2013181在發酵生產2，3-丁二醇主產物中的應用，本發明所使用的菌株Bacillus subtilis SFA-H43已經在申請人以往申請的專利中公開(一株產3-羥基丁酮的芽孢桿菌及其應用，授權專利號:ZL2013 10289934.7);本領域技術人員應當了解，發酵生產2，3- 丁二醇主產物是指代謝產物以2，3-丁二醇占主要比例。
[0007]本發明的另一目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CCTCCNo:M 2013181以葡萄糖為原料高產2，3-丁二醇的方法。
[0008]優選的，發酵結束時控制發酵液中的葡萄糖濃度在5g/L以上；
[0009]優選的，控制發酵液中的葡萄糖濃度為當發酵液中的葡萄糖濃度降至0-10g/L時結束發酵，或當發酵液中葡萄糖濃度低于10g/L時，通過分次補加或流加的方式向發酵罐中補加葡萄糖。
[0010]本發明采用的具體技術方案如下:
[0011]⑴種子培養
[0012]該菌株在4°C冰箱保藏，使用前劃線于LB培養基斜面活化，于35-38°C培養基中培養24-36h。挑取新鮮培養的斜面一環，接種于含有40-60mL種子培養基的500mL三角瓶中，搖床轉速150-200r/min，培養溫度35_38°C，培養時間12_16h，此為一級種子液。將培養成熟的一級種子液以1-10%的接種量接種于裝有800-1200mL種子培養基的5000mL三角瓶中，培養溫度35-38°C，轉速為120-180r/min，培養時間為8_12h，此為二級種子液。種子培養基:葡萄糖50-100g/L，酵母膏3-8g/L，玉米漿干粉5-lOg/L，氯化鈉l_5g/L，pH7.0-7.2
[0013]⑵5L發酵
[0014]5L發酵罐裝液量3.0-3.5L，米用一級種子液接種，接種量5_10%。發酵條件為:溫度35-38°C，攪拌轉速為300-350r/min，通氣量為1.5-2.0L/min，當發酵液中的葡萄糖濃度降至0-10g/L時結束發酵。5L發酵進程如附圖2所示。發酵培養基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏 5-10g/L，玉米漿干粉 5-10g/L，尿素 l_3g/L，pH6.0-6.5。
[0015](3)50L 發酵
[0016]50L發酵罐裝液量33-38L，米用二級種子液接種，接種量為5-10%。發酵條件為:溫度35-38°C，攪拌轉速為300-350r/min，通氣量為1.0-1.5m3/h。當發酵液中的葡萄糖濃度降至0-10g/L時結束發酵。發酵進程如附圖3所示。發酵培養基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏 5-10g/L，玉米楽干粉 5-10g/L，尿素 l_3g/L，pH6.0-6.5，
[0017](4)50L補料發酵
[0018]發酵罐裝液量30-35L，米用二級種子液接種，接種量5_10%。發酵條件為:培養溫度35-38°C，攪拌轉速為300-350r/min，空氣流量為1.0-1.5m3/h。當發酵液中葡萄糖濃度低10g/L時，通過分次補加或流加的方式向發酵液中補加葡萄糖50-100g/L。分次補料發酵進程如圖4所示。發酵培養基:葡萄糖150-200g/L，酵母膏5-10g/L，玉米漿干粉5_10g/L，尿素l_3g/L，pH 6.0-6.5。流加葡萄糖溶液濃度70-75%，滅菌后使用。
[0019]本發明取得了以下技術效果:
[0020](I)拓展了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CCTCC No:M 2013181 的應用范圍，發明人初期該菌株發現用于3-羥基丁酮的發酵生產，其產生極少量的2，3-丁二醇；由于不同的菌株，如不同的枯草芽孢桿菌，其生理生化性質和代謝種類和能力往往差異較大，其積累的主要代謝產物也有所不同，如CN101008019A所公開的枯草芽孢桿菌CGMCCN0.1869以產3-羥基丁酮為主，不產生丁二酮、2，3-丁二醇等常見副產物，CN101851598A所公開的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 6_7以產2，3-丁二醇為主；而本發明所述的菌株通過改變培養條件，即可分別實現兩種不同產物的積累。
[0021](2)實現了采用安全性菌株Bacillus subtilis SFA-H43轉化葡萄糖高產2，3_ 丁二醇，產率達 110-120g/L。
【附圖說明】
[0022]圖1菌株SFA-H43的3_羥基丁酮發酵進程
[0023]圖2菌株SFA-H43的2，3~ 丁二醇發酵進程，5L發酵罐培養
[0024]圖3菌株SFA-H43的2，3~ 丁二醇發酵進程，50L發酵罐培養
[0025]圖4菌株SFA-H43的2，3_ 丁二醇發酵進程，50L發酵罐分批補料培養
【具體實施方式】
[0026]以下結合技術方案詳細敘述本發明的具體實施例
[0027]實施例一Bacillus subtilis SFA-H43 的 5L 發酵罐培養
[0028](I)種子液的制備
[0029]從新鮮斜面接種一環至裝有50mL種子培養基的500mL三角瓶中，培養溫度37°C，搖床轉速180r/min，培養時間為12h，細胞密度(0D600)為0.68X10。種子培養基組成:葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，玉米楽干粉10g/L，氯化鈉2g/L，pH7.0。
[0030](2)發酵培養
[0031]米用5L發酵罐進行發酵培養，裝液量為3.5L，將上述培養的種子液按5%的接種量接種于發酵培養基中，通風量為1.6L/min，攪拌轉速為300r/min，定時取樣檢測發酵液的細胞密度((?600)、葡萄糖和2，3-丁二醇濃度。發酵周期72小時。最終檢測發酵液中的2，3- 丁二醇濃度為75.0g/L。發酵培養基的組成:葡萄糖160g/L，酵母膏10g/L，玉米漿干粉10g/L，尿素2g/L，滅菌前用10mol/L的氫氧化鈉將pH調至6.0，115°C滅菌20min。
[0032]實施例二Bacillus subtilis SFA-H43 的 5L 發酵罐培養
[0033](I)種子液的制備
[0034]從新鮮斜面接種一環至裝有60mL種子培養基的500mL三角瓶中，培養溫度36°C，搖床轉速180r/min，培養時間為16h，細胞密度(0D600)為0.73X10。種子培養基組成:葡萄糖80g/L，酵母膏8g/L，玉米楽干粉5g/L，氯化鈉1.5g/L，pH7.0。
[0035](2)發酵培養
[0036]米用5L發酵罐進行發酵培養，裝液量為3.5L，將上述培養的種子液按10 %的接種量接種于發酵培養