一種新的農桿菌介導的大白菜原位轉基因方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，尤其涉及農桿菌介導的大白菜原位轉基因方法。
【背景技術】
[0002] 1、大白菜CSrawica 是十字花科蕓薹屬CSrawica)中最 重要的蔬菜作物之一，是我國栽培面積最大、分布最廣、人們普遍喜愛的蔬菜，被稱為"當家 菜"。長期以來，我國大白菜主要是通過雜交育種進行品種改良。但傳統的雜交育種方法， 存在育種年限長、成本高、親本自交多代生活力易退化等諸多弊端，隨著組織培養和DNA重 組技術的建立和不斷完善，轉基因技術已經成為改良農藝性狀，解決農業生產難題的重要 手段。目前以農桿菌介導的轉化方法主要有借助細胞組織培養技術的離體轉化和直接在植 株上進行的原位滲入轉化，例如花粉管通道法、真空滲入法等。
[0003] 目前，大白菜遺傳轉化最常使用的方法仍是利用普通的組培方式進行的農桿菌介 導法，即將要轉化的植株的子葉等外植體作為轉化受體在預培養基上培養生長，然后浸入 攜帶外源基因的農桿菌菌液中3~5min，在無菌濾紙上吸干菌液。首先，被浸染的外植體 在共培養基上培養一定的時間，以確保外源基因充分整合到染色體上；其次，被浸染的外植 體轉移至恢復培養基，恢復培養基內含有一定濃度的抑制細菌生長的抗生素(有氨芐青霉 素、羧芐青霉素、利福平等）；最后，外植體被轉移至含有一定濃度選擇性抗生素的選擇培養 基，篩選抗性芽，誘導生根，再生植株，經抗性分子鑒定獲得轉基因植株。近年來，大白菜轉 基因研究隨著其高頻植株再生體系的建立和不斷完善取得了顯著進展。例如朱常香等、楊 廣東等、王關林等、王洋等、張艷萍等、楊廣東等分別將抗蕪菁花葉病毒基因、修飾豇豆胰蛋 白酶抑制劑基因、抗菌肽基因、白細胞介素一 2基因、硝酸還原酶基因、雪花蓮凝集素基因 GNA等用農桿菌介導法導人大白菜基因組，獲得了轉基因植株。
[0004] 據近幾年研究報道，以農桿菌介導的大白菜遺傳轉化所使用的受體主要是無菌苗 的子葉或下胚軸，都是體細胞組織，具有兩套染色體，外源基因同時插入同源染色體相同座 位的可能性極小，因而轉化植株常常是雜合的，后代會發生分離。曹鳴慶等以小孢子作為遺 傳轉化受體，得到了抗除草劑轉基因植株。因為小孢子同時具備了單倍體和單細胞兩個特 性，轉化體經加倍后即可成為純合的二倍體。
[0005] 但是，由于大白菜組織培養難度較大，再生體系較難建立，一定程度上制約了轉基 因技術在大白菜育種中的應用，因此，尋求不依賴于組織培養途徑的轉化方法，是許多從事 基因工程研究的研究者非常關注的事情。花粉管通道法是一種以生殖細胞作為外源DNA的 受體細胞，借助開花植物復雜的有性生殖過程，獲得轉基因植株的方法。其原理主要是授粉 后使外源DNA能沿花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合 子或早期胚胎細胞。據統計，外源DNA直接導入植物技術已相繼在近30種作物上獲得成功， 在水稻、小麥等經濟作物上的應用例子比較多，而在蔬菜育種上的應用相對少一些，尤其對 一些蔬菜小品種報道不多。例如王雷等人通過花粉管通道法介導il-4基因轉化大白菜，"哈 白二號"大白菜在花期授粉后24h左右進行轉化，轉化率達1. 15%。
[0006] 原位滲入轉化法最早獲得成功是Feldmann和Marks利用農桿菌侵染剛剛萌發的 種子，從其后代種子中篩選出了抗性株，并通過分子雜交進行了驗證。而真空滲入轉化法 作為原位滲入轉化的一種，它是由Bechtold等將植物病理學中用來輔助植物病毒進入植 株的方法，應用到了擬南芥植株的農桿菌基因轉化上，其轉化頻率較種子轉化提高了 3~4 倍。該方法避開了組織培養的過程，以生長中的植株作為轉化受體，從后代種子中直接篩選 抗性株，為植物的轉基因工作開辟了新的途徑。但遺憾的是目前這種方法除在擬南芥中被 廣泛應用外，其他植物中僅在不結球白菜、苜蓿中有成功轉化的報道。曹鳴慶等將不結球白 菜利用真空滲入法轉化獲得了轉基因白菜。劉凡等利用農桿菌介導的真空滲入轉化法將馬 鈴薯蛋白酶抑制劑基因/i)導人不結球白菜"49菜心"中，獲得抗蟲性材料。
[0007] 盡管大白菜轉基因技術取得一些進展，但由于離體轉化比較困難，大白菜農桿菌 介導的離體轉基因方法受到制約，花粉管通道法和真空滲入法僅在不結球白菜上試驗成 功，在接球大白菜上未見報道，且這些方法也存在一些弊端，實踐上迫切需要發展一些更高 效、簡易、快捷、重復性好的技術。
[0008] 本發明的植物原位轉基因方法（inplantatransformation)是一種更加簡便、 快速、可靠，且無需經過組織培養階段即可獲得大量轉化植株的新的基因轉化方法，其根本 特點就在于它不需要組織或細胞培養手段，也無需抽真空而達到植物在活體（invivo)而 非離體（vitro)狀態下的轉化。目前，這種方法的應用還僅局限于擬南芥，本方法為尋找蕓 薹屬作物乃至十字花科作物高效遺傳轉化的非組織培養方法提供借鑒，意義重大。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的是提供一種新的大白菜原位轉基因途徑，不需要組織培養和復雜的 操作而直接獲得轉基因植株的方法，以克服現有技術的不足。
[0010] 本發明是這樣實現的： (1)配制農桿菌浸染液：從平板上挑取含有待轉基因的單菌落，接種到含篩選抗生素的YEB液體培養基（pH7. 0)中，28°C、225r/min的條件下培養至OD6m=O. 6~0. 8。取800ML 菌液稀釋到50mL無抗生素的YEB液體培養基中，相同條件下培養至OD6tw=O. 6~0. 8時， 4000r/min離心5min，沉淀物用50mL液體MS培養基將菌體重懸。
[0011] (2)大白菜原位轉基因方法：大白菜于田間正常生長至開花始期，去除已開的花， 保留花蕾，用鑷子輕輕將花蕾剝開小口，將花序全部浸泡在農桿菌浸染液里2~4min。正常 管理，采收種子。
[0012] (3)大白菜轉化后代的抗性鑒定：將收獲的大白菜種子播種于含抗生素的培養基 MS+lmg/LBA上，挑選具有抗性的幼苗進行轉化植株的分子檢測。
[0013] (4)大白菜轉化植株的分子檢測：采集具有抗性的大白菜幼嫩葉片，用常規的 CTAB法提取葉片DNA進行PCR檢測。取PCR反應產物IOul，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳， 觀察如有待轉基因的條帶，則說明是轉基因陽性植株，轉化成功。
[0014] 由于采用了上述技術方案，與現有技術相比，本發明有7大優點： (1)針對由于白菜攜帶不易再生的AA基因組型，白菜難分化這一特點，本方法不需要 外植體的再生系統，這對組織培養時不定芽發生困難的大白菜基因型的轉基因研究具有較 大的應用價值，在其他作物涉及植株再生的轉基因方法遇到困難時，亦具有很好的應用前 景。
[0015] (2)簡化和縮短轉基因育種過程，直接得到轉化種子，無須進行繁瑣的組織培養， 避免了組培過程中容易污染導致轉化失敗，也免除了從離體原生質到再生植株漫長的人工 培養過程，還減少了基因型的影響。
[0016] (3)操作簡便、快速、高效、成本低、易于掌握，無需昂貴的儀器設備和化學藥品，研 究人員可直接在田間操作。
[0017] (4)具備基因工程的先進性，不僅可以導入供體的總DNA，也可是部分DNA片段或 目的基因，導入的DNA易于整合，被轉基因所控制的性狀在受體植株中易于穩定。
[0018] (5)在轉基因表達載體構建中，有時可省略抗生素標記基因，因而在轉基因產品 中，將可能不含有抗生素表達，安全性會更好。
[0019] (6)保留了常規育種的基本特點（可直接按照育種要求選擇轉化后代）。
[0020] (7)在現有技術中，國內外從沒有將大白菜花蕾直接浸泡在含待轉基因的農桿菌 浸染液里，在活體狀態下原位轉化而直接獲得大白菜轉化種子。
[0021] 本發明與現有技術農桿菌介導離體轉化法、花粉管通道法及真空滲入法相比，有 以下3大不同點： (1)常用的由農桿菌介導的離體轉化方法需經過以下步驟：一、選擇植物材料進行無菌 培養，培養子葉、下胚軸、小孢子等組織或器官作為轉化受體(外痔提）；二、建立高頻再生體 系；三、材料選擇壓的確定；四、農桿菌的活化；五、受體材料的預培養；六、感染材料和共培 養；七、抑菌培養；八、選擇培養；九、轉基因植株鑒定；十、轉基因后代的遺傳穩定性分析。 該方法的缺點是：_大白菜是蕓薹屬中最難再生的一類作物，由于白菜具有AA基因組，與 蕓薹屬其他具有BB和CC基因組的植物相比，其不定芽和植株再生比較難；賴大白菜組織培 養及轉化再生能力對基因型依賴性比較強，不同的基因型其再生率和轉化難易程度差異很 大，所以對于特定的大白菜材料，需要進行再生和轉化體系的優化; 1i不同的抑菌抗生素和 轉化的農桿菌菌株對外植體的分化有一定的影響；響有些品種存在著可再生細胞和轉化感 受態細胞部位不一致的問題，造成逃逸體、嵌合體、轉化率低下等；有的品種農桿菌與受 感染細胞間易產生過敏性反應，導致感染部位的褐化和壞死；?細胞脫分化和再分化中有 可能產生體細胞變異以及轉基因植株的育性降低或喪失，這有可能干擾轉基因植株的分析 及利用。
[0022] 本發明的轉基因過程與上述不同，是直接將大白菜花蕾浸泡在含待轉基因的農桿 菌浸染液里，直接獲得大白菜轉化種子，不需組織培養過程，簡單易行，大大節約了時間，縮 短了轉化進程，且避免了植物組織培養過程中可能產生的體細胞變異及基因型依賴性等上 述6