黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因及其編碼蛋白和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物工程技術領域，尤其涉及的是一種黃酮醇多位點葡萄糖基轉 移酶CSUGT73A20基因及其編碼蛋白和應用。
【背景技術】
[0002] 植物中的黃酮類物質，屬于苯并啦喃環結構的一類天然化合物。它們多在苯并口比 喃環母核的3-0, 5-0, 7-0, 3'-0,4'-0等多羥基位點上與糖基團結合形成黃酮苷類物質。茶 樹中的黃酮類主要為柚皮素（N)、山奈素（KC)，山奈酚（K)和芹菜素（A)，如圖1所示。
[0003] 黃酮及黃酮苷類物質是茶葉多酚的重要組成成分，不僅是茶湯中澀味等品質成 分物質，也是構成湯色色澤的重要因子。茶樹黃酮及其苷類具有多種生理功能如抗氧化 等，是當今藥物和保健品熱門開發的對象。
[0004] 黃酮醇糖基化在很多植物中主要發生在3或7-OH上，但是，在2004年Lim關于擬 南芥糖基轉移酶的研究中發現，一些糖基轉移酶沒有嚴格區域選擇性，可以在槲皮素的3、 7、3'，或4'位點糖苷化，在某些情況下，甚至形成少量的3, 7二槲皮素糖苷和7, 3'二槲 皮素糖苷。而對山奈酚非特異性糖基化的研究只在2008年Markus的報道中發現：FaGT6 和FaGT7糖基轉移酶基因主要形成3-0-山奈酚葡萄糖糖苷，少量的7-0-山奈酚葡萄糖糖 苷和4'-0_山奈酚葡萄糖糖苷。并且FaGT6糖基轉移酶基因還能形成少量的一種二葡萄糖 糖苷。而對茶樹中CsUGT73A20糖基轉移酶基因研究發現它不僅可以形成多位點山奈酚單 葡萄糖糖苷，還可以非特異性形成多種多位點山奈酚二葡萄糖糖苷（山奈酚3, 7-0-二葡萄 糖糖苷，山奈酚3,4' -0-二葡萄糖糖苷和山奈酚7, 3' -0-二葡萄糖糖苷），如圖1所示。 隨著反應時間延長，其中3, 7-0-二葡萄糖糖苷產量增加顯著。迄今為止，茶樹中編碼依賴 尿苷二磷酸葡萄糖的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基因的功能還沒有得到驗證。本發明研 究一種能編碼尿苷二磷酸葡萄糖依賴的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基因，構建重組工程 菌，提供一種生產多種黃酮醇葡萄糖苷的方法。
[0005] 柚皮素苷、山奈素苷、山奈酚苷和芹菜素苷都是黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基 因的產物。有一些黃酮苷類物質如柚皮素苷、山奈素苷、部分山奈酚單糖苷可以商品化購 買。但是還有一些黃酮苷類物質，如山奈酚雙氧葡萄糖苷，由于天然含量低純化難度大，至 今沒有市場商品產物。
【發明內容】
[0006] (一）解決的技術問題
[0007] 針對現有技術的不足，本發明提供了一種從茶樹鮮葉中分離獲得的黃酮醇多位點 葡萄糖基轉移酶CSUGT73A20基因及其編碼蛋白和應用，以提供一種新的能夠編碼茶樹黃 酮醇多位點葡萄糖基轉移酶基因及其編碼蛋白。利用本發明的重組工程菌，可以大量合成 山奈酚雙氧葡萄糖苷，為山奈酚雙氧葡萄糖苷等多位點黃酮醇單糖苷及雙糖苷生物合成的 工程化奠定基礎。
[0008] (二）技術方案
[0009] 為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：
[0010] -種黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因，該基因具有如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列。
[0011] 優選的，所述的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CSUGT73A20基因應用于多位點黃 酮醇單糖苷及雙糖苷生物合成。
[0012] -種黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因的編碼蛋白，所述編碼蛋白 具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
[0013] 優選的，所述的編碼蛋白應用于多位點黃酮醇單糖苷及雙糖苷生物合成。
[0014] 一種重組質粒，所述重組質粒含有所述黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CSUGT73A20 基因，具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
[0015] 優選的，所述重組質粒為將黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因連接 到pMal-c2X載體的多克隆位點中構建獲得，命名為pMal-c2X-CsUGT73A20。
[0016] -種轉基因工程菌，所述轉基因工程菌含有所述的重組質粒，或其基因組中整合 有外源的所述的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因序列，具有如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列。
[0017] 優選的，所述轉基因工程菌為含有所述重組質粒的大腸桿菌Novablue (DE3)菌 株，或其基因組中整合有所述黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因序列的大腸 桿菌Novablue (DE3)菌株。
[0018] (三）有益效果
[0019] 本發明提供了一種從茶樹鮮葉中分離獲得的黃酮醇多位點葡萄糖基轉移酶 CsUGT73A20基因及其編碼蛋白和應用，首次克隆并驗證了形成多位點黃酮醇單糖苷及雙糖 苷相關的黃酮醇葡萄糖基轉移酶CsUGT73A20基因功能，本發明還提供了含有CsUGT73A20 基因的重組質粒、轉基因工程菌和重組蛋白，為通過生物工程方法大量合成多位點黃酮醇 單糖苷及雙糖苷，進一步開展多位點黃酮醇單糖苷及雙糖苷的生物合成調控研究奠定基 礎。
【附圖說明】
[0020] 圖1是類黃酮物質（柚皮素、山奈素，山奈酚和芹菜素）及其部分葡糖糖糖苷物質 的化學結構式。
[0021] 圖2是CsUGT73A20重組蛋白（rCsUGT73A20)的SDS-PAGE蛋白電泳分析圖;其中， M為蛋白Marker;1為重組質粒誘導前；2為重組質粒誘導后；3為誘導后破碎后上清；4為 誘導后破碎后沉淀；5為純化后蛋白。
[0022] 圖3是HPLC分析rCsUGT73A20催化的酶活產物結果圖，其中，圖3-A~3-F以 UDP-葡萄糖為糖供體，以黃酮醇化合物（山奈酸，山奈酚3-0-葡萄糖苷，山奈酚7-0-葡萄 糖苷，山奈素，芹菜素，柚皮素）作為糖受體的HPLC圖譜；
[0023] 圖4是重組CsUGT73A20蛋白催化合成黃酮醇葡萄糖苷產物的一級質譜和二級質 譜分析圖譜；其中，圖4-A~4-F為山奈酚雙氧葡萄糖苷，山奈酚葡萄糖苷，山奈素雙氧葡萄 糖苷，山奈素葡萄糖苷，芹菜素葡萄糖苷，柚皮素葡萄糖苷的一級和二級質譜圖；
[0024] 圖5為pMal_c2X質粒圖譜
【具體實施方式】
[0025] 為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例 以及實施例附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實 施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范 圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀 器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0026] 一、材料
[0027] 1、茶樹品種：舒茶早（Camelliasinensis(L. )0?Kuntze.var.sinensiscultivar Shuchazao)，采集茶樹鮮葉，迅速用液氮冷凍，儲存于_80°C冰箱中備用；
[0028] 2、pMal_c2X載體；
[0029] 3、大腸桿菌Novablue(DE3)表達宿主菌：購于上海北諾生物科技有限公司；
[0030] 4、LB培養基：稱取IOg的NaCl，5g的酵母提取物，IOg的胰蛋白胨，加入950mL去 超純水攪拌溶解，用lmol/L的NaOH調pH至7. 0,加水定容至lOOOmL，高壓蒸汽滅菌15min， 即獲得LB液體培養基，LB固體培養基為在LB液體培養基中加入15g的瓊脂粉即可；
[0031] 5、質量比為40%的葡萄糖溶液：稱取40g葡萄糖，加入超純水溶解攪拌均勻，定容 至IOOmL，110°C滅菌IOmin;
[0032] 6、氨節青霉素母液（Amp+，lOOmg/mL):稱取Ig氨節青霉素Amp，溶于IOmL滅菌水， 過濾除菌，分裝小管，_20°C保存；
[0033] 7、lmol/L的IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷）：稱取2. 383gIPTG，溶于滅菌 超純水，定容至10mL，過濾除菌，分裝并于-20°C保存；
[0034] 8、蛋白純化緩沖液：上柱緩沖液：稱取0? 37gEDTA，11. 67gNaCl，2. 42gTris， 0. 15gDTT于足量純水中，攪拌使其充分混勻。用稀鹽酸調其PH至7. 4,定容至1L，即得上 柱緩沖液。洗脫緩沖液：IL上柱緩沖液中加入3. 60g麥芽糖，溶解攪拌均勻。
[0035] 9、IOOmM的pH7. 5的Tris-HCL緩沖溶液：稱取I. 1214gTris加水至90mL攪拌溶 解均勻，加稀HCL調pH至7. 5,補水定容至IOOmL;
[0036] 10、體積比為1 %的乙酸：用移液管量取IOmL色譜級乙酸溶液于IL容量瓶中，用 超純水定容至1L。
[0037] 二、CsUGI73A20 基因的克隆：
[0038] 1、設計帶有表達載體pMal_c2X載體的多克隆酶切位點的特異引物，其引物序列 如SEQIDNO:3 和SEQIDNO:4 所示：
[0039] SEQIDNO:3 :正向引物：5' -
[0040] CGCGGATCCATGGGTAAGCTTAAATTCTTCTTC-3 '
[0041] SEQIDNO:4 :反向引物：5' -
[0042] ACGCGTCGACTTATGAACTCAATTCTTGTATTAG-3' ；
[0043] 2、按照TaKaRaRNAiso試劑盒和RNAisoPlus試劑盒說明書，提取茶樹