水稻淹水脅迫響應rs1基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及水稻淹水脅迫響應RSl基因，屬植物基因工程技術領域，具體地說是 一種水稻淹水脅迫響應RSl基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 脅迫反應為植物體在抵抗不良的外界環境的脅迫時，植物體細胞感受外界環境的 變化并將信號傳遞到細胞內，從而誘導細胞表達各種應答基因共同來抵御不良環境對植物 體傷害的一個過程。
[0003] 水稻是世界上重要的糧食作物之一，全世界約有50%的人口以其為主食。目前，環 境的不斷惡化，引起了全球水資源的嚴重匱乏與分布不平衡，導致了局部地區洪澇災害的 頻繁發生。洪澇災害已成為限制水稻生產的主要因子之一，據統計，東南亞地區洪澇災害每 年給水稻造成的損失約1億美金。
[0004] 水稻是一種半水生作物，對水分的需求量很大，但正常生長的水層深度也有一定 范圍，長期沒頂淹水下不能生存。具體表現為，水稻在淹水條件下，其有氧呼吸受到抑制，水 稻由有氧呼吸轉成以生成乙醇的無氧酵解途徑，進而引發乙醇、R〇S、NO等有害物質的生成。 同時，淹水條件下，水稻的光合作用也受到嚴重的抑制，這些都影響了水稻的正常生長，造 成減產，甚至絕收。
[0005] 因此，發掘水稻淹水脅迫響應基因，并應用于水稻的遺傳改良，以期提高水稻的耐 淹水性，是保證水稻高產、穩產的有效途徑之一。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供水稻淹水脅迫響應RSl基因，并提供RSl基因在水稻耐淹 水性遺傳中的改良應用。
[0007] -種水稻淹水脅迫響應RSl基因，RSl基因的DNA序列為序列表中SEQIDNO: 1所 不。
[0008] 所述水稻淹水脅迫響應RSl基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQID NO: 2所示。
[0009] 所述的水稻淹水脅迫響應RSl基因可用于增強水稻耐淹水性，培育耐淹水性增強 的水稻新種質、新材料。
[0010] 一種重組載體，所述的重組載體含有所述RSl基因的基因序列。
[0011] -種培育轉水稻RSl基因的植株、組織、器官的方法，所述的方法是通過轉基因技 術將該基因導入植物組織、細胞、器官中，并通過組織培養等方法，獲得轉水稻RSl基因的 細胞、組織、器官、植株等。
[0012] 本發明一種水稻淹水脅迫響應RSl基因及其應用，其優點是：
[0013] 1、選用Ubi啟動子驅動RSl基因，過表達的轉基因株系顯著提高了水稻的耐淹水 性，耐淹水效果明顯，在淹水環境中，RSl基因可以明顯提高水稻的耐淹水性，保證水稻的高 產、穩產；
[0014] 2、RS1基因來源于水稻，因此轉RSl基因的水稻減少了人們對食品安全性的擔憂；
[0015] 3、揭示水稻耐淹水性形成的分子機制，為水稻和其它植物的耐淹水性遺傳改良提 供了新的基因資源。
【具體實施方式】
[0016]本發明工作原理如下：
[0017] 把RSl基因克隆到pCAMBIAubil300轉化載體上，導入農桿菌中，通過農桿菌法介 導法將該基因轉化到水稻受體細胞中，再采用組織培養等技術手段獲得轉基因植株。
[0018] 1、水稻RSl基因的獲得
[0019] 選取生長狀況良好的水稻自交系M202和其近等基因系M202 (SublA)分別進行0、 5天的淹水處理，提取各處理的葉片總RNA。所得的RNA樣品一部分由深圳華大基因公司進 行RNA-seq分析；剩余各處理總RNA，分別反轉錄合成cDNA第一鏈。RNA-seq結果發現，一 基因在淹水處理下表達量大幅提高，表明該基因受淹水脅迫誘導表達，參與淹水脅迫響應， 將該基因命名為RSl。
[0020] 使用GA(赤霉素）、ACC(促進劑1 一氨基環丙烷一 1 一羧酸）對1周大的幼苗M202、 M202 (SublA)進行處理，結果顯示，RSl基因受GA、ACC誘導，表達水平顯著提高（GA、ACC是 植物淹水脅迫響應的重要信號途徑）。因此，綜合該基因的研究，將RSl基因作為水稻耐淹 水的候選基因。
[0021] 上述總RNA的提取方法以及CDNA第一鏈合成的實驗方法分別與下述中的步驟2、 步驟3相同。
[0022] 2、水稻M202 (SublA)葉片總RNA的提取
[0023] ①、取生長狀況良好的水稻的葉片0.Ig于液氮中研磨后轉入2.OmL離心管中，加 I.OmLTrizol提取液，渦旋振蕩15-20秒后，在4°C環境溫度下，以轉速12000rpm離心5 分鐘；
[0024] ②、取上清液于一無RNase2.OmL離心管，加入體積比為24 :1的氯仿與異戊醇， 且添加總量為200yL，渦旋振蕩15-20秒后，在4°C環境溫度下，以轉速12000rpm離心5 分鐘；
[0025] ③、取②中上清液至一無RNase2.OmL離心管中，添加異丙醇，且添加的異丙醇為 上清液體積的2/3,混勻，以轉速12000rpm離心10分鐘；
[0026] ④、去③中去溶液后加入Iml70%乙醇，洗滌5分鐘；
[0027] ⑤、去④中所加入的ImL70%乙醇，并將離心管放于工作的超凈工作臺5分鐘，待 乙醇揮發殆盡后，加入50yL無RNaseddH20,溶解RNA樣品，測定濃度后保存于-80°C冰箱， 備用。
[0028] 3、cDNA第一鏈的合成
[0029] 取步驟2中獲得的RNA合成第一鏈cDNA;
[0030] cDNA第一鏈合成反應體系如下：10X反轉錄酶buffer2yL，IOmMdNTPsIyL， Randomprimers2yL，RNase抑制劑O.liiL，反轉錄酶0.5iiL，RNA5yg，加無RNaseddH20 至總體積20yL;
[0031] 反應程序如下：25°C10分鐘，37°C2小時，85°C5分鐘，4°C保存；
[0032] 第一鏈cDNA的合成參照Promega反轉錄系統A3500操作手冊操作，cDNA第一鏈 合成后，用CldH2O稀釋5倍后于-20°C冰箱保存。
[0033] 4、RSl基因的克隆
[0034] 使用RT-PCR技術，克隆RSl基因：
[0035] RT-PCR反應體系：10Xbuffer2yL，IOmMdNTPsIyL，IOmMleftprimerIyL， IOmMrightprimerlyL，phusionDNApolymeraseO. 2yL,cDNAtemplateIyL，ddH20 13. 8yL;
[0036] 用于RT-PCR擴增反應的RSl基因引物，其序列如下：
[0037] leftprimer:5,GGTGGGCTGGGTAGGACGAA3'，right primer:5'GCGAGCGGGAAGTAGAAGGG3' ；
[0038] 反應程序如下：95°C3分鐘；95°C40秒，55°CI分鐘，72°CI分鐘，35個循環；72°C 延伸5分鐘；4 °C保存；
[0039] 將上述獲得的RT-PCR產物置于1 %瓊脂糖凝膠電泳、檢測，并于紫外儀下切割目 標條帶，然后使用凝膠回收試劑盒回收產物。
[0040] 5、轉化載體的構建
[0041] ①、將步驟4中回收的條帶克隆到pENT-D載體中；
[0042] 反應體系：40-50ngPCR產物，dilutedsalt(稀釋 5 倍的鹽溶液）IyL，pENT-D 0? 5yL，加ddH20 至 6yL;
[0043] 反應產物混勻后以轉速5000rpm離心1分鐘，25°C放置1小時。
[0044] ②、將步驟①中的產物電擊法轉入DHlOB大腸桿菌感