一種cd20核酸適配體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及⑶20核酸適配體，以及所述適 配體在制備治療CD20陽性腫瘤藥物中的應用及其在制備檢測和/或治療CD20陽性腫瘤細 胞制劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 非霍奇金淋巴瘤（NHL)是世界上嚴重威脅人類健康的腫瘤之一，在過去的50年 中，NHL在世界范圍內有著穩定的增長趨勢，不容忽視。據統計，它占所有癌癥病例數的 5. 1%，在男性常見腫瘤中排名第八位，在女性中是第11位。2008年，共有355900新增NHL 病例，造成了 191400人的死亡。已有研究表明，大多數的NHL來源于B細胞。NHL可在不同 的年齡階段發生，尤其是在60歲以上的人群身上。
[0003] 臨床上治療NHL的傳統方法就是化療。然而，由于細胞毒藥物在殺傷腫瘤細胞的 同時也會對正常組織產生損傷，從而限制了化療的進度和用藥程度，所以化療很難將患者 體內腫瘤細胞完全去除，導致了腫瘤的復發或者轉移。并且，多重化療藥物聯合使用會使患 者對藥物產生耐藥性。所以亟需研發新型的針對NHL的治療手段。
[0004] 近些年靶向治療得到了人們的關注。靶向治療是指將抗腫瘤藥物通過靶向分子 特異性地呈遞到腫瘤細胞上，使得藥物在腫瘤組織上有更高的富集而在正常組織中含量很 少，則藥物對腫瘤組織的殺傷增強而對正常組織殺傷較弱，從而有助于清除體內的腫瘤細 胞，并大大降低毒副作用。靶向治療是有希望改善抗腫瘤化療療效的重要方向之一。
[0005] 靶向治療系統的構建，需要靶向分子和抗腫瘤藥物。其中，靶向分子可以與腫瘤細 胞上的腫瘤靶點特異結合。一個理想的腫瘤靶點應在腫瘤細胞膜表面高表達，而在正常組 織或陰性組織中低表達或不表達。⑶20是一個33-37kDa的膜蛋白，它的表達嚴格遵循B細 胞造血系統。⑶20抗原表達于90%以上的B淋巴瘤細胞，而不表達于造血干細胞、原始B 淋巴細胞、正常血細胞以及其他正常組織。由于80% -85%的NHL來源于B細胞，并且這些 細胞中將近95%的細胞高表達⑶20,所以⑶20是靶向治療NHL的重要靶點。
[0006] 美羅華是一個CD20的單克隆抗體，它是首個被FDA批準的靶向治療NHL的藥物。 盡管美羅華臨床上產生了一定的療效，但是它仍有一些弊病，比如一些患者對其不敏感，且 一些患者使用一段時間后藥物則不再有療效，并對進一步的治療產生了抵抗反應。故此，研 發一種新型的靶向CD20陽性NHL的治療策略是很必要的。
[0007] 近些年，除了單克隆抗體，一些其他類別的靶向分子也得到了人們的關注。核酸適 配體（aptamer)就是其中之一。核酸適配體是一段短鏈的DNA或RNA，它們可通過堿基之間 的配對以及相互作用產生特有的三維結構，從而與靶標高親和、高特異地結合。同時，與抗 體相比，核酸適配體還有一些獨特的優勢，如可大批量合成、成本低、易修飾、易穿透腫瘤組 織、免疫原性低等等。因此，核酸適配體在腫瘤的靶向治療有重要的應用潛能。然而。到目 前為止，科學文獻中還沒有報導過針對CD20的核酸適配體。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種新的⑶20核酸適配體，所述核酸適配體能夠與⑶20表 位肽及CD20陽性的腫瘤相結合，所述核酸適配體包括如下核酸序列（SEQIDNO:1) :5'-TG CGTGTGTAGTGTGTCTGTGTGTGTGTAGCGTGTCTGCTCTTAGGGAITTGGGCGG-3 '（下文中，也將該核酸適 配體稱為"CZ17"）。
[0009] 進一步地，本發明提供了一種SEQIDNO:1所示核苷酸序列經截斷后的 核酸適配體序列，所示經截斷后的核酸適配體的核苷酸序列具有與⑶20表位肽及 CD20陽性的腫瘤相結合的能力，優選地，所述經截斷后的核酸適配體的核苷酸序列為 5' -TGTAGCGTGTCTGCTCTT-3'。
[0010] 進一步地，本發明所述核酸適配體，在核酸適配體的兩端，可以進行基團修飾，所 述修飾的基團可以是選自氨基、羧基、巰基、熒光分子、生物素、膽固醇或聚乙二醇基團修 飾。本發明的一個實施例中，提供了在CZ17的兩端分別進行生物素、另一端進行熒光素修 飾后得到的經修飾的核酸適配體分子，經修飾后的核酸適配體分子，具有與CD20表位肽以 及CD20陽性的腫瘤細胞相結合。
[0011] 本發明的再一方面，可以對所述的核酸適配體的堿基進行修飾，如硫代、氨代、氟 代、甲氧基修飾，得到堿基修飾后的核酸適配體分子，優選地，對所述堿基進行硫代修飾，硫 代修飾的方式為將堿基磷酸基團中的氧原子用硫原子替代。本發明的一優選實施例中，將 所述核酸適配體中所有的堿基A進行硫代，得到硫代核酸適配體CZ17,經硫代修飾后，其具 有較未經修飾的核酸適配體更為優異的穩定性，可抗核酸酶。
[0012] 本發明所述核酸適配體，還能夠選擇性的結合CD20陽性的腫瘤細胞，而與CD20陰 性的細胞結合較弱。
[0013] 更為重要的是，對本發明所述核酸適配體堿基進行修飾后，如對其中的堿基A進 行硫代修飾，相比其它非硫代修飾的單鏈DNA序列，該硫代修飾的核酸適配體具有了一定 的抵抗核酸酶的能力，在血清中的存在時間顯著延長。
[0014] 基于此，該核酸適配體可以直接攜帶細胞毒性藥物（如阿霉素），選擇性的殺傷 CD20陽性的腫瘤細胞，因此，本發明的再一方面，提供了本發明所述核酸適配體在制備用于 檢測和/或治療CD陽性的腫瘤（如NHL)制劑中的應用。
[0015] 本發明的有益效果在于：本發明的⑶20核酸適配體具有：（1)能和⑶20表位肽以 較高的親合力結合，Kd值為100. 7nM; (2)能選擇性的結合CD20陽性的腫瘤細胞，而與CD20 陰性的細胞結合較弱；(3)優選地可以直接攜帶細胞毒性藥物阿霉素，選擇性的結合并殺 傷CD20陽性的腫瘤細胞。
[0016] 本發明的又一方面，提供了一種組合物，該組合物包括本發明所述的核酸適配體， 以及制藥上可接受的載體或賦形劑。
[0017] 本發明中，所述載體如可以是納米藥物載體，將本發明所述核酸適配體偶聯到所 述納米藥物載體上（納米載體如脂質體、膠束、納米粒等），可以作為CD20靶向分子，用于 CD20陽性腫瘤的靶向治療，將適配體偶聯到納米載體上的方法，本發明技術人員可以根據 現已有的制劑技術進行。或者本發明所述的載體也可以是造影劑粒子（如納米鐵、包裹了 造影劑的納米粒等），將所述適配體偶聯到造影劑粒子上，作為⑶20靶向分子，用于⑶20陽 性腫瘤的靶向顯影，將適配體偶聯到造影粒子上的方法，本發明技術人員可以根據現已有 的制劑技術進行。或者，本發明所述的載體還可以是染色分子（如辣根過氧化物酶），作為 ⑶20靶向分子，用于⑶20陽性腫瘤的組化染色。
[0018] 本發明的又一方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物，包括本發明所述的 核算適配體、以及選自至少一種抗腫瘤藥物，和制藥上可接受的載體或賦形劑。
[0019] 本發明中，所述的核酸適配體和至少一種抗腫瘤藥物，所述復合體是所述核酸適 配體與化療藥物形成的復合體，該復合體可用于CD20陽性的腫瘤的治療。
[0020] 本發明中，抗腫瘤藥物，選自抗代謝類抗腫瘤藥（如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、 吉西他濱或雷替曲塞）、抗生素類抗腫瘤藥物（如絲裂霉素C、博來霉素、阿霉素、多柔比星、 表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌）、植物堿類抗腫瘤藥（如長春堿、紫杉醇或羥基喜樹堿）、 激素類抗腫瘤藥（如他莫昔芬、來曲唑或強的松）、鉬類抗癌藥（如順鉬、卡鉬、奧沙利鉬、奈 達鉬或樂鉬）或抗腫瘤小分子靶向藥物（如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼）。
[0021] 由于本發明所述核酸適配體能夠選擇性的結合CD陽性的腫瘤細胞，而與CD20陰 性的細胞結合較弱，因此本發明的又一方面，提供所述適配體作為CD20陽性的腫瘤化療靶 向藥物載體的應用，將化療藥物結合于所述核酸適配體上，進行腫瘤放化療時，可以選擇性 地殺傷CD20陽性的腫瘤細胞，而對正常細胞沒有毒性，所述的化療藥物，可以是選自代謝 類藥物如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他濱、雷替曲塞，抗癌抗生素類藥物如絲裂霉 素C、博來霉素、阿霉素、多柔比星、表柔比星、吡柔比星，植物堿類如長春堿、紫杉醇、羥基喜 樹堿，抗腫瘤激素類如他莫昔芬、來曲唑、強的松，雜類如順鉬、卡鉬、米妥蒽醌，抗腫瘤小分 子靶向藥物如吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼，更優選地，所述化療藥物選自氟尿嘧啶、氟 尿苷、甲氨蝶呤、順鉬、吉西他濱、雷替曲塞、絲裂霉素、博萊霉素、長春堿、紫杉醇、羥基喜樹 堿、卡鉬、他莫昔芬、來曲唑、強的松、吉非替尼、伊馬替尼或拉帕替尼。
[0022] 本發明所述核酸適配體還可以偶聯到納米藥物載體上，如脂質體、膠束、納米粒 等，作為CD20靶向分子，用于CD20陽性腫瘤的靶向治療，基于此，本發明還提供了一種藥物 組合物，所述藥物包括本發明所述的核酸適配體，至少一種抗腫瘤藥物，和藥物可接受的載 體，所述核酸適配體與至少一種抗腫瘤藥物以復合體形式存在，所述載