水稻根尖特異表達啟動子POsRo3的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種水稻 根尖特異表達啟動子P0sR〇3及其應用，該啟動子能夠在水稻轉基因調控體系中驅動目標 基因在水稻根中特異表達。
【背景技術】
[0002] 植物基因能夠正常表達是依賴基因上游的啟動子序列。在植物基因工程中， 我們可以利用具有不同表達調控水平的啟動子來驅動目標基因的表達。其中在植物中 使用最廣泛的啟動子為CaMV35S啟動子。該啟動子是煙草花葉病毒基因的啟動子，能 在大部分植物中對異源基因進行啟動表達，是組成型啟動子（ChuaNH，BenfeyPN.The cauliflowermosaicvirus35Spromoter:combinatorialregulationoftranscription onplants.Science，1990,250:959-966h從病毒中克隆出來的基因啟動子序列應用 到植物基因工程中，可能存在潛在的生物不安全性，因此，人們也從植物本身克隆活性 強的組成型啟動子。例如來源于擬南芥的PTSBl和PPHYB啟動子（NaomiSS，Ichiro M..ConstitutivepromotersavailalefortransgeneexpressioninsteadofCaMV35S RNApromoter:Arabidopsispromotersoftryptophansynthaseproteinsubunitand phytochromeB.PlantBiotechnology，2002, 19(1) :19-26);廣泛應用地單子葉植物轉基 因工程中，并作為研究的水稻Actinl和玉米Ubiquitin啟動子，據報道，這些啟動子在大麥 和玉米中的表達效率是 35S的 15倍（SchledzewskiK，MendelRR.Quantitativetransient geneexpression:Comparisonofthepromotersformaizepolyubiquitinl,rice actinI,maize-derivedEmuandCaMV35Sincellsofbarley,maizeandtobacco. TransgenicRes.1994, 3:249-255) 〇
[0003] 盡管組成型啟動子能高效、非特異性的啟動外源基因表達，但在實際應用中逐漸 暴露出一些問題，這種外源基因的組成型表達往往會造成大量異源蛋白的積累，從而打 破植物原有的代謝平衡，妨礙植物的正常生長。例如生長遲緩、生長期長、甚至不育和死 亡（PinaMT,SkinnerJSjParkEJ，JekniZ,HayesPM,ThomashowMF，ChenT.Useofa stressinduciblepromotertodriveectopicAtCBFexpressioninprovespotato freezingtolerancewhileminimizingnegativeeffectsontuberyield.Plant BiotechJ，2007, 5:591-604h因此，能夠驅動外源基因在植物組織器官中定時、定點表達 的組織特異性啟動子逐漸成為研究的重點。
[0004] 植物根系在土壤養分吸收中起重要作用，并且能與土壤微生物相互作用、分泌抗 病蟲物質以抵抗病菌對植物的侵襲。更重要的是，根系能夠在各種非生物脅迫條件下保護 地上部分，如干旱、酸性條件及重金屬。當與養分吸收和耐脅迫相關的基因被特異的表達在 根部細胞后，植物則會在營養匱乏及脅迫條件下正常生長。
[0005]目前在植物中，雖然已有少數根部特異表達的啟動子被克隆并應用于基因功能的 研究，但這些啟動子中大部分只是在根部表達較強，并不完全特異在根中表達。另外，能夠 在水稻根尖特異表達的啟動子更是鮮為人知。而根尖在植物根部中的作用又極其重要，由 此可見，發展更多的水稻等禾谷科作物的根尖特異型啟動子對基礎性研究和遺傳改良應用 都具有重要的意義。
【發明內容】
[0006] 針對上述問題，本發明的目的是提供一種驅動外源基因在水稻根中特異性表達的 啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉化子以及該啟動子的應用。
[0007] 具體而言，本發明提供一種水稻根尖特異表達啟動子P0sR〇3,其特征在于，所述水 稻根尖特異表達啟動子P〇sRo3提取自水稻屬植物。
[0008] 優選地，所述水稻根尖特異表達啟動子P0sR〇3包含：
[0009] 1)序列表中SEQIDNo:1或2所示的DNA序列；或者
[0010] 2)在嚴格條件下與含有1)中的DNA序列雜交后具有啟動子功能的DNA序列；或 者
[0011] 3)與1)或2)限定的DNA序列具有70%-75%的同源性，且具有啟動子功能的DNA 序列；或者
[0012] 4)與1)或2)限定的DNA序列具有75%-80%的同源性，且具有啟動子功能的DNA 序列；或者
[0013] 5)與1)或2)限定的DNA序列具有80%-85%的同源性，且具有啟動子功能的DNA 序列；或者
[0014] 6)與1)或2)限定的DNA序列具有85% -90%的同源性，且具有啟動子功能的DNA 序列；或者
[0015] 7)與1)或2)限定的DNA序列具有90% -95%的同源性，且具有啟動子功能的DNA 序列；或者
[0016] 8)與1)或2)限定的DNA序列具有95%以上的同源性，且具有啟動子功能的DNA 序列；或者
[0017] 9)在SEQ ID NO: 1或2中所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的 具有啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0018] 10)在SEQIDNO: 1或2中所示的核苷酸序列中去除一個或多個核苷酸后所獲得 的具有啟動子功能的核苷酸序列；或者
[0019] 11)在SEQIDNO: 1或2中所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得 的具有啟動子功能的核苷酸序列。
[0020] 優選地，所述水稻根尖特異表達啟動子P0sR〇3提取自日本晴水稻，所述水稻根尖 特異表達啟動子P〇sRo3由SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列構成。
[0021] 另一方面，本發明提供一種含有所述水稻根尖特異表達啟動子P0sR〇3的重組表 達載體或表達盒。
[0022] 優選地，所述重組表達載體為在植物表達載體的多克隆位點插入所述的水稻根尖 特異表達啟動子P0sR〇3得到的重組質粒，在所述重組表達載體中，所述水稻根尖特異表達 啟動子P〇sRo3連接于載體中待表達的基因序列的上游。在一種實現方式中，所述待表達的 基因為Gus基因。該重組表達載體為將SEQIDNo:l所示的序列即P0sRo3或啟動子P0sRo3 構建于PCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIA1391-P0sRo3。或者待表 達基因可以為任何對水稻根尖具有改善功能的基因。
[0023]優選地，所述待表達基因為具有改善水稻根性狀能力的基因。
[0024]另一方面，本發明提供一種獲取用于轉基因植物培育的宿主菌的方法，其特征在 于，所述方法包括將包含所述的水稻根尖特異表達啟動子P〇sRo3、所述的重組表達載體、或 所述的表達盒轉入根癌農桿菌。
[0025]另一方面，本發明提供一種獲取用于轉基因植物培育的轉化子的方法，其特征在 于，所述方法包括將所述水稻根尖特異表達啟動子P0sR〇3轉入大腸桿菌XL-Blue感受態細 胞中，經菌落PCR篩選獲得陽性克隆，將所獲得的陽性克隆和植物載體構建植物表達載體， 再將所述植物表達載體轉入根癌農桿菌，并利用所述根癌農桿菌通過介導方法獲得轉基因 植物細胞、組織、器官或植株。
[0026] 另一方面，本發明提供一種所述水稻根尖特異表達啟動子P0sR〇3在培育轉基因 植物中的應用，其特征在于，所述應用包括：將所述水稻根尖特異表達啟動子P0sR〇3連接 于載體中待表達的基因序列上游，從而構建重組表達載體；將所述重組表達載體轉化到水 稻細胞、組織或器官中進行培育，優選地，所述待表達基因為水稻雌蕊特異表達基因。
[0027] 另一方面，本發明提供一組擴增所述水稻根特異性強表達啟動子P0sR〇3的全部 或其任意片段的引物對，其特征在于，所述引物對包括正向引物和反向引物，所述正向引物 的核苷酸序列如SEQIDNO:3所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0028] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)的根特異性強表達啟動子，本文中稱為P0sRo3或啟動子P0sRo3。具體而 言，本申請的發明人發現日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括轉錄 起始位點在內的1807bp的DNA序列，具有驅動目標基因水稻根中特異性表達的功能，并且 分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0029] 需要說明的是，本發明所提供的啟動子序列中，SEQIDNo. 1中序列開頭的 "ACTTTCTTGTTGTCCATTCCAT"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列，共計22bp; 序列末尾的序列"CTACCGCACCAACAGTTAATAA"為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存 序列（該留存序列與反向引物的相應序列互補），共計22bp;該DNA序列中剩余的部分則 為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強調的是，本文中所提到的啟動子既可以指上述整 個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列，即SEQIDNo.2。需要說明的 是，即便本領域技術人員在本發明的基礎上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發 明的保護范圍之內。
[0030] 綜上所述，本發明的發明人發現、提取并鑒定了日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)P0sRo3基因上游包括轉錄起始位點在內的1807bp的DNA序列，并將其命名 為啟動子P〇sRo3。將該序列經酶切后連接到植物雙元表達載體pCAMBIA1391上，獲得相應 的重組質粒（即重組表達載體），利用該重組質粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105,然后用農桿 菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水稻植株。對獲得的轉基因水稻進行Gus組織 化學染色檢測發現，轉基因植株的根特別是根尖部位Gus基因顯著表達，而其他部位如莖 葉等中均沒有明顯的GUS活性，從而證明該1807bp的序列具有驅動基因在根尖部位特異性 表達的活性。
[0031] 本發明所述的啟動子序列可與植物雙元表達載體連接，用于取代組成型啟動子。 并且，該啟動子序列可以與所需的靶標基因連接，構建重組植物表達載體，經轉化后，在水 稻的根部位特異性的驅動靶標基因的表達，增加轉基因的效果，避免不必要部位表達帶來 的物質能量浪費，有效改良水稻的特性。
[0032] 技術效果
[0033] 本發明所克隆的水稻啟動子P0sR〇3能夠調控基因在水稻根尖中特異性集中表 達，在實際應用中具有顯著價值。通過該啟動子對農作物品種進行基因改造改善植物根尖 的生長特性，如通過該啟動子驅動目標基因在植株根尖中表達，例如，可以增強根發育過程 中對環境的抵抗力，比如耐寒性、耐熱性等等，從而培育出理想的轉基因植物品種。
【附圖說明】
[0034] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0035] 圖1為將P0sRo3啟動子構建于pCAMBIA1391載體質粒中的示意圖，其中圖1中A