一種啟動子元件OsEmb2及利用其培育轉基因水稻的方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種水稻 胚特異表達啟動子0sEmb22及利用其培育轉基因水稻的方法和應用，該啟動子能夠在水稻 轉基因調控體系中特異性的驅動目標基因的表達。
【背景技術】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有一半人口以大米為主食，我國稻 谷年消耗量和產量占世界總量的三分之一。我國是人口大國，提高糧食產量一直是重大的 社會問題。可耕地面積的減少和人口的增加，加劇了對水稻產量和品質的要求，高產、優質 日益成為水稻研究的重點問題。水稻的基因組相對較小，是禾本科作物功能基因組研究的 模式植物。
[0003] 胚是被子植物有性生殖過程中形成的，在植物發育中具有重要的生物學意義。胚 的發育始于合子，經過原胚和胚的分化發育階段，最后達到成熟。融合形成的二倍體合子， 既保持了物種遺傳的相對穩定性，以為后代中可能出現新的遺傳性狀、新變異提供了基礎， 為研究植物遺傳和育種學提供了重要的理論依據。
[0004] 基因通過表達來體現其功能，維持生物體的有序生長發育和各項活動。基因的表 達調控一直是分子生物學研究的熱點和中心課題之一，分為轉錄水平的調控，轉錄后水平 的調控（mRNA的加工、成熟等），翻譯水平的調控等不同層面。啟動子是精確啟動基因表達 的"開關"，在轉錄水平的調控過程中扮演著重要的角色，是基因在轉錄水平的調控過程中， 影響基因表達水平的最直接和最有力的順式調控原件。借助基因工程的方法，利用組織特 異性的啟動子，對特定基因進行的表達研究進行調控，或者對作物進行針對性的育種改造， 都具有十分重要的應用價值。因此，研究組織特異性啟動子的功能序列，對于基因的表達調 控機制的研究具有重要的意義。但是，有些基因，例如非結構基因會發生基因的轉移，從而 很難找到在特定的組織中特異性表達的相應啟動子，再例如，有一些miRNA在組織中特異 性存在，但與結構基因相比，由于miRNA太短、匹配區域太多，真正據此找到的具備組織特 異性的miRNA啟動子寥寥無幾。
[0005] 因而，分離、獲得種子胚特異性表達的啟動子，既有助于更細致地理解植物胚胎 發育中形態發生與細胞分化的分子機理，又能廣泛應用于植物基因工程研究中，使外源目 的基因能在特定的組織中高效表達，以實現對外源基因表達的定時、定點、定量三維精確調 控，在改良作物品質的同時又可減少對植物的不利影響。胚特異性高強度表達啟動子，可以 定時定向調控外源有用蛋白的合成，既節約能源，保證了植物正常的生理活動不受干擾，同 時又能提高外源有用蛋白在種子中的儲藏水平。同時，利用胚特異啟動子可提高外源基因 在植物胚中的表達和累積水平，也可改良種子品質、將具有生理活性的蛋白或短肽導入種 子中創制保健型功能新品種、利用種子作生物反應器生產有用外源蛋白或可食性疫苗，增 加農產品科技附加值等。因此，胚特異啟動子及其應用為揭示整個植物胚胎發育的過程和 機理的研究，利用生物技術改良種子品質，分子醫藥農場等研究奠定了基礎，具有極大的應 用前景。
[0006] 但是，目前人們所發現并驗證的胚特異性啟動子的數目還很有限，并且也缺乏分 離鑒定本底信號低、特異性高的優質啟動子。
【發明內容】
[0007] 針對上述問題，本發明的目的是提供一種分離鑒定本底信號低、特異性高的新型 啟動子，這種啟動子對作物基因工程將有著重要的意義。
[0008] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種啟動子元件，其特征在于，所述啟動 子元件選自下組：
[0009] (a)核苷酸序列包含SEQIDNO: 1所示序列的多核苷酸；
[0010] (b)核苷酸序列與SEQIDNO: 1所示序列的同源性彡95%，較佳地彡98%，且具有 水稻胚中特異啟動功能的啟動子活性的多核苷酸；
[0011] (C)如SEQIDNO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1~60個，較佳地1~ 30,更佳地1~6個核苷酸，且具有水稻胚中特異啟動功能的啟動子活性的多核苷酸。
[0012] 本領域技術人員可以預期b)和c)中的啟動子序列與SEQIDNo: 1所示的DNA序 列具有相同的功能，即驅動目標基因在植物胚中表達。
[0013] 另一方面，本發明提供一種構建物，其特征在于，所述構建物含有目標基因以及與 目標基因可操作連接的所述啟動子元件。
[0014] 另一方面，本發明提供一種表達盒，其特征在于，所述表達盒從5'至3'依次具有 下述元件：所述啟動子元件、基因ORF序列和終止子。
[0015] 另一方面，本發明提供一種載體，其特征在于，所述載體含有所述的啟動子元件、 或所述的表達盒。優選地，該載體為重組表達載體，在所述重組表達載體中，所述啟動子元 件0sEmb2連接于目標基因的上游。在一種實現方式中，該重組表達載體為將SEQIDNo: 1 所示的序列即0sEmb2或啟動子0sEmb2構建于pCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文 中稱為pCAMBIA1391-〇sEmb2。
[0016] 另一方面，本發明提供一種獲得宿主細胞的方法，其特征在于，所述方法包括，將 所述的載體轉入目的細胞、或者在目的細胞的染色體上整合帶有目標基因的所述的啟動子 元件、或者在目的細胞的染色體上整合所述的表達盒。
[0017] 另一方面，本發明提供所述的啟動子元件、所述的構建物、權利要求3所述的表達 盒的用途，用于特異性調控目標基因在水稻胚中的表達，所述用途將所述的啟動子元件與 所述目標基因相連接，將連接產物轉入水稻細胞，并且利用轉入連接產物的水稻細胞培育 轉基因水稻。
[0018] 另一方面，本發明提供一種在水稻胚中特異性表達目標基因的方法，其特征在于， 所述方法包括以下步驟：
[0019] (a)提供一構建物，所述構建物含有目標基因以及與該目標基因可操作連接的所 述的啟動子元件；
[0020] (b)將步驟（a)得到的構建物導入水稻細胞，獲得轉化的水稻細胞；
[0021] (C)將步驟（b)中轉化的水稻細胞再生成水稻植株，從而使所述目標基因在水稻 胚中特異性表達。
[0022] -種制備轉基因水稻的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
[0023] (a)提供下述水稻細胞，所述水稻細胞含有所述載體、或其染色體整合有所述啟動 子、或其染色體整合有所述表達盒；
[0024] (b)將（a)的水稻細胞再生為水稻植株，從而獲得轉基因水稻。
[0025] 另一方面，本發明提供一種獲得水稻愈傷組織或水稻體細胞胚胎的方法，其特征 在于，所述水稻愈傷組織或水稻體細胞胚胎包括下述水稻細胞或由下述水稻細胞構成：所 述水稻細胞含有所述的載體、或其染色體整合有所述的啟動子元件、或其染色體整合有所 述的表達盒。
[0026] 本發明的啟動子元件0sEmb2可以用作水稻胚特異表達啟動子。
[0027] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列來源于日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)，本文中稱為0sEmb2或啟動子0sEmb2。具體而言，本申請的發明人發現日 本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括轉錄起始位點在內的2024bp的 DNA序列，具有驅動目標基因水稻胚中特異性表達的功能，并且分離克隆、并鑒定了該DNA 序列的功能。
[0028] 再一方面，本發明提供上述水稻胚特異表達啟動子在培育轉基因植物中的應用。 所述應用包括將本發明提供的上述水稻胚特異表達啟動子連接于載體的待表達的基因序 列上游（例如，將所述啟動子序列插入目標基因之前），從而構建重組表達載體，將所述重 組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
[0029] 并且優選地，所述應用可以用于改良植物生長特性，所述植物為單子葉植物，例如 水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優選為水稻。
[0030] 本發明中所提供的啟動子的DNA序列為（與序列表中SEQIDNo: 1中相同）：
[0032] 需要說明的是：上述啟動子元件的DNA序列中，序列開頭以斜體并加粗表示的序 列"ATGCGTTGTACTTGATCTAGAG"為獲得啟動子元件過程中使用的正向引物的留存序列，共計 22bp;序列末尾以斜體并加粗表示的序列"GAAACAACACAAATTGCACAAA"為獲得啟動子元件 過程中使用的反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物的相應序列互補），共計22bp; 該DNA序列中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強調的是，本文中所提到 的啟動子既可以指上述整個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需 要說明的是，即便本領域技術人員在本發明的基礎上，采用其他引物獲得了類似序列，其也 落入本發明的保護范圍之內。
[0033] 綜上所述，本發明的發明人發現、提取并鑒定了日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare) 0sEmb2基因上游包括轉錄起始位點在內的2024bp的DNA序列，并將其命名 為啟動子0sEmb2。將該序列經酶切后連接到植物雙元表達載體pCAMBIA1391上，獲得相應 的重組質粒（即重組表達載體），利用該重組質粒轉化根癌農桿菌菌株EHA105,然后用農桿 菌介導的方法進行水稻的轉化，得到轉基因水稻植株。對獲得的轉基因水稻進行Gus表達 檢測發現，轉基因植株的胚部位有Gus基因表達，從而證明該2024bp的序列具有驅動基因 在胚部位特異性表達的活性。
[0034] 本發明所述的水稻胚特異表達啟動子0sEmb2可與植物雙元表達載體連接，用于 取代組成型啟動子。并且，該啟動子序列可以與所需的靶標基因連接，構建重組植物表達載 體，經轉化后，在水稻的胚部位特異性的驅動靶標基因的表達，增加轉基因的效果，改良水 稻的特性。
[0035] 技術效果
[0036] 本發明所克隆的水稻啟動子0sEmb2能夠調控基因在水稻胚中特異性集中表達， 在實際應用中具有顯著價值。通過該啟動子對農作物品種進行基因改造，如通過該啟動子 驅動目標基因在植株中表達，可以提高和改善水稻的特性，從而培育出理想的轉基因植物 品種。
【附圖說明】
[0037] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0038] 圖1為將