鑒別草珊瑚與3種混淆品的分子特異性標記引物及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鑒別草珊瑚與3種混淆品的分子特異性標記引物及方法，屬于生 物技術領域。
【背景技術】
[0002] 草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb. )Nakai，俗稱腫節風，通常用于治療花斑癬、 紫癜、風濕性關節痛、外傷。現代研究表明有治療癌癥、抗腫瘤、抗炎、抗病毒和非特異性免 疫增強上等藥理作用。然而，野生植物種質資源近年來已經減少，由于金粟蘭、寬葉金粟蘭、 及己外形與草珊瑚極其相似，很容易與草珊瑚相混淆。但是他們有不同的屬性和藥用價值， 這些易混植物也都有相應的肝毒性作用，及己在嚴重肝毒性病例報告和動物的毒性研究中 已經證實有顯著肝毒性，這限制了它在臨床上的應用。
[0003] 雖然草珊瑚新鮮葉片可以通過靜脈、附屬物和葉的非腺毛維管束結構之間的顯微 鑒定差異從其混淆品中鑒別出來，但是粉末或粉碎片形式的草珊瑚和易混植物通過形態學 和組織學技術是很難識別的。在過去的幾年中，利用化學分析技術如TLC、HPLC、MS等識別 草珊瑚及其相關制劑已經有所記載。雖然這些方法在某種程度上可以補充形態學或組織學 鑒定的局限性，但化學指紋圖譜只能檢測部分化合物，只能提供有限的物種組成信息，不能 給我們提供完全鑒別出草珊瑚的方法，特別是在和它極為相似的物種鑒別中。因此，選擇恰 當的鑒別草珊瑚產品的方法對監測質量至關重要。
[0004] 隨著分子生物學的發展，DNA分子標記如RAPD、ISSR和SSR等分子標記，ITS (Internaltranscribedspacer)等DNA條形碼技術提供了可靠的識別藥材的方法。然而， 這些基于基因組DNA的分子標記技術容易受到基因組DNA降解的影響，由于核基因組DNA 比葉綠體DNA拷貝數少，在加工過的藥材中更容易遭破壞而導致無法通過其分子標記技術 進行鑒別。葉綠體DNAtrnL-F區域的包含trnL(UAA)內含子和間隔，即trnL(UAA)-trnF (GAA)區作為DNA條形碼，它可以很容易利用通用引物進行擴增，這一序列已被證明可用于 對多種植物在種水平的識別，被廣泛用于植物產品的檢測。本課題組在前期研究中也發現， 對于干燥或經加工過的藥材，基于葉綠體DNAtrnL-F區域的鑒別技術比基于核基因組DNA 的分子標記技術更為穩定有效。
[0005] 本研究對草珊瑚、金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的trnL-F區序列進行測序，分析其 序列結構和特征，尋找單核苷酸多態性（singlenucleotidepolymorphismSNP)分子標 記，設計分別識別草珊瑚，金粟蘭，寬葉金粟蘭和及己的特異識別引物，建立多重PCR技術， 可快速簡單鑒別草珊瑚與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己3種混淆品的方法。本發明為草珊瑚 與3個與其相似混淆種的分子鑒別提供了有效方法，對有效的鑒別和保護4種中藥種質資 源具有非常重要的意義，檢索未見草珊瑚與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己等3種混淆品的同 時進行分子鑒定的發明專利申請。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種鑒別草珊瑚與3種混淆品的分子特異性標記引物及 方法，可快速簡單鑒別草珊瑚與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己3種混淆品的方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 根據前期測序實驗所得的草珊瑚、金粟蘭，及己和寬葉金粟蘭的trnL-F基因序 列，分析其特異SNP位點，分別設計可特異識別草珊瑚的上游特異性引物SgF(5' -TGATTCTGATAGATTTTTGA AGAAITGA- 3'）、可特異識別金粟蘭的上游特異性引物CspF(5'-AACTATGITTCTCA TTCACTCTACTCGA- 3'）、可同時特異識別寬葉金粟蘭和及己的上游特異性引物〇8?(5'_ TGAAGATCCAAGAAAITCCGACAC- 3'）同時與下游通用引物trnL-Ff(5'-AITTGAACT GGTGACACGAG- 3'）構建多重PCR體系：總量為20yL，從植物中提取I0ng的DNA 作為擴增模版，加入IyLIXTransStartTopTaqDNA聚合酶（TransGen公司），2yL 10XTransStartTopTaqBuffer,dNTP2. 5mM, 0? 2yM下游引物trnL-Ff和上游的 3 個特 定的引物SgFXspF與CsF各0.1yM，其余為無菌水。構建多重PCR體系，反應程序如下： 95°C預變性2分鐘，95°C變性30s，50°C引物退火30s和72°C延伸2分鐘，35 個循環；最后一個循環在72°C延伸7分鐘，以確保完整的延伸PCR產物。只有草珊瑚取 得了 575bp，金粟蘭生成特定的375bp，及己和寬葉金粟蘭生成特定的166bp，草珊瑚及其 易混植物的混合樣品中，這三個特定的序列都可被PCR擴增出來。
[0008] 本發明的優點在于： 由于僅根據某些特征活性化學成分的存在進行鑒別，易受植物成長環境等外在條件的 影響，很難進行準確鑒別，特別是混合樣品的鑒別。本方法基于遺傳背景的進行分子定量， 不受藥材的產地等外在因素的影響，相對于化學方法，更為準確，也更為簡單方便。
[0009] 由于葉綠體DNA比基因組DNA的拷貝數更多，在干燥及加工后的產品中更為穩定， 本方法利用葉綠體DNA作為檢測對象，比利用基因組DNA作為檢測對象，更適合用于對在干 火呆及加工后的廣品的鑒定。
[0010] 本方法可對草珊瑚與3種常見的混淆品同時進行分子鑒定，準確確定3種混淆品 的存在與否，效率更高，更便捷。
【附圖說明】
[0011] 圖1利用引物trnL-Ff，SgF，CspF，CsF多重PCR的產物凝膠電泳（M: 2logDNA ladder;1-5 :草珊瑚；6-9 :金粟蘭；10-11 :及己；12-13 :寬葉金粟蘭；14-15 :草珊瑚、金粟 蘭、及己混合物；16 :草珊瑚、金粟蘭、寬葉金粟蘭混合物。
【具體實施方式】
[0012] 儀器 PCR儀（Eppendorf，型號5332)，電泳系統（北京市六一儀器廠，型號DYY-12)，低溫 冷凍離心機（Eppendorf，型號5810R)，凝膠成像分析儀（BIO-RADChemiDocXRS)，微量移 液器（Eppendorf)〇
[0013]試劑 2XCTAB提取液，IXTAE緩沖液，瓊脂糖（Promega公司），溴化乙錠（Fluka公 司），TransStart?TopTaqDNAPolymerase(北京全式金公司），三氯甲燒、無水乙醇、 異丙醇均為國產分析純。
[0014] 材料 本研究實驗樣品是由福建中醫藥大學魏藝聰講師鑒定并收集的采自不同產地的樣品： 十三種草珊瑚、四種金粟蘭、四種寬葉金粟蘭和三種及己樣本是從中國不同產地上收集。五