一種輔酶q10生產中的類球紅細菌噬菌體的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及類球紅細菌噬菌體檢測領域，具體而言，涉及一種輔酶QlO生產中的 類球紅細菌噬菌體快速檢測方法。
【背景技術】
[0002] 輔酶QlO是一種抗氧化劑，廣泛使用于心血管藥物、保健品和化妝品。目前，全球 的輔酶QlO主要在中國生產，大多是采用一系列不同規模的發酵設備來逐級放大規模地培 養類球紅細菌（Rhodobactersphaeroides)，然后從發酵物中提取產品。和其他產品的細 菌發酵生產一樣，細菌發酵過程中如果發生噬菌體污染將導致產量和產品質量下降甚至停 產，給生產廠家帶來巨大的損失。因此，在生產過程中，避免和控制噬菌體污染一直是發酵 行業一個嚴重和難以解決的問題。
[0003] 目前，輔酶QlO生產過程中的噬菌體檢測主要采用常規的雙層板培養的檢測方 法，這種方法需要的時間比生產本身需要的時間還要略長。等檢測結果出來，該批次發酵產 物已經介入下一階段的放大生產，不具備指導生產的意義。
[0004] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種輔酶QlO生產中的類球紅細菌噬菌體快速檢測方法， 選用特定的引物進行測定，取任一階段和規模的發酵生產中的待檢測樣品進行PCR檢測全 過程大概需要兩個小時，實現了快速準確的噬菌體檢測，若發現有噬菌體污染，立即停止本 次發酵產物的擴大生產，這樣可以完全避免后一階段的擴大生產中的噬菌體污染事件發 生，減少不必要的損失。
[0006] 為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
[0007] -種類球紅細菌噬菌體的基因組片段，如SEQIDNo.1所示。
[0008] 該基因片段為類球紅細菌噬菌體所特有，以SEQIDNo. 1基因序列設計引物，可檢 測是否有類球紅細菌噬菌體的存在。
[0009] 優選地，以SEQIDNo. 1基因序列設計引物，即可對輔酶QlO生產中的類球紅細菌 噬菌體進行定量PCR檢測。
[0010] 針對輔酶QlO發酵生產過程中污染類球紅細菌的狀況，通過大量試驗驗證，測定 出SEQIDNo. 1基因序列為類球紅細菌特異片段，在其他細菌中不存在；以該基因序列設計 引物，進行定量檢測，特異性好，檢測簡便。
[0011] -種輔酶QlO生產中的類球紅細菌噬菌體的檢測方法，選擇以下三對引物中的任 一對引物，并以每對引物對應的探針進行熒光定量PCR檢測即可；
[0012] 每對引物及其對應的探針如下所示：
[0013] 組1 :以PFl和PRl作為引物，并以probel作為探針進行熒光定量PCR檢測，其中，
[0014] PFl：GCGCTCTATTTCATCCCCGA；
[0015] PRl：CGGTATATTATGACCGGCGC；
[0016] probeI：CGGAACACTTTGTCAAGCGA；
[0017] 組2 :以PF2和PR2作為引物，并以probe2作為探針進行熒光定量PCR檢測，其中，
[0018] PF2 ：CTCGTCGCCATTCCAATCGG；
[0019] PR2 ：CGGGGCCACAAACTTAGGTA；
[0020] probe2：GCTCGGACTGCCAGAAAATC；
[0021] 組3 :以PF3和PR3作為引物，并以probe3作為探針進行熒光定量PCR檢測，其中，
[0022] PF3 ：ATGAACGCGACCCTTAAGCT；
[0023] PR3 ：ACGATTATGTTGGGCGTTGC；
[0024] probe3 :GTCCTGAAAATGCGAGGGTG。
[0025] 本發明提供的一種輔酶QlO生產中的類球紅細菌噬菌體的檢測方法，針對輔酶 QlO發酵生產過程中污染類球紅細菌的狀況，選用特定的引物及其探針測定類球紅細菌的 污染情況，檢測快速且靈敏度高，直接取任一階段和規模的發酵生產中的發酵物提取基因 組DNA，通過熒光定量PCR檢測即可，方法簡單，檢測全過程大概需要兩個小時，實現了快速 準確的噬菌體檢測，若發現有噬菌體污染，立即停止本次發酵產物的擴大生產，這樣可以完 全避免后一階段的擴大生產中的噬菌體污染事件發生，減少不必要的損失。
[0026] 優選地，所述熒光定量PCR檢測之前先制作由標準樣品的拷貝數和Ct值構成的標 準曲線。
[0027] 其中的標準樣品為不同拷貝數濃度的噬菌體基因組DNA特定片段或克隆了該片 段的質粒線性化DNA。該片段是對類球紅細菌噬菌體的基因組DNA進行PCR擴增所得或者 按照本申請提供的序列人工合成所得，該片段含有上述的檢測引物和探針的結合位點。
[0028] 進一步地，所述熒光定量PCR檢測采用的待測樣品為待測發酵物中提取的總基因 組DNA;
[0029] 待測樣品與所述標準標樣以相同的PCR體系以及PCR程序進行實時熒光定量PCR， 所述待測樣品得到的Ct值直接與所述標準曲線比對即可得到前述噬菌體基因組DNA特定 片段的拷貝數濃度，即噬菌體濃度。
[0030] 進一步地，所述熒光定量PCR檢測采用的待測樣品通過以下方法制備：稱取 0. 05-0. 15g的發酵物提取基因組DNA，提取的基因組DNA溶解于50-150y1的超純水中，即 得。達到快速提取的要求，并且提取得到的基因組DNA濃度易于檢測。
[0031] 進一步地，所述標準曲線的縱橫坐標分別為起始模板（不同濃度的標準樣品）的 拷貝數的對數值和定量PCR測定所得的Ct值。Ct值和起始模板的不同拷貝數的對數值具 有很好的線性關系，更便于將待測樣本的數值與標準曲線比對以得到檢測結果。
[0032] 優選地，所述起始模板由以下方法制備：
[0033] (a)、合成目標片段SEQIDNo. 1 ;
[0034] (b)、以引物PF和PR對所述目標片段進行PCR擴增，擴增后對目標片段切膠純化 回收，其中
[0035] PF：TTTCGTCGTATCCGTCTCGGT；
[0036] PR：GATGTCTACCTCTTGATATAC；
[0037] (c)、測定回收的DNA的質量濃度，計算轉化為拷貝數濃度，對該樣品進行梯度稀 釋即得到一系列不同拷貝數濃度的標準樣品。
[0038] 先對所述人工合成的片段進行擴增，得到的擴增片段含有本發明提供的三對檢測 引物和三個探針對應的結合位點，通過片段擴增，以該擴增得到的片段作為標準曲線所用 的標準樣品。通過對標準樣品的定量PCR擴增，得到標準曲線，從而增加待測樣本進行熒光 定量PCR檢測的準確度。
[0039] 為了進一步純化標準樣品，增加標準曲線的準確度，從而增加對待測樣本檢測的 準確度，優選地，所述步驟（c)還包括：將回收的目標片段連接至載體上，轉化到質粒宿主 細菌中，培養細菌后提取質粒，該質粒酶切線性化，純化后測定DNA的質量濃度，計算轉化 為拷貝數濃度，對該樣品進行梯度稀釋即得到一系列不同拷貝數濃度的標準樣品。
[0040] 進一步地，所述載體為T載體；
[0041] 所述質粒擴增具體為：
[0042] 將回收的目標片段連接至載體，轉化至E.coliDH5a感受態細胞，挑取陽性克隆 進行增菌培養。
[0043] T載體通過市售即可。
[0044] 為了得到的標準曲線更穩定，并具有更大的范圍，以便于待測樣本的比對，進一步 地，所述起始模板的不同拷貝數的范圍為=LOXlO2拷貝-1.0X10 6拷貝，以10倍進行等 分。
[0045] 另外，一般當噬菌體污染開始出現，檢測值在數萬拷貝/微升以上，設置該范圍能 很靈敏的檢測到噬菌體的污染。當在小規模的放大發酵中檢測到噬菌體后，該批發酵產品 應當立即廢棄并嚴格對發酵裝備進行消毒。放大發酵一般平行有幾個發酵罐，選取沒有檢 測到噬菌體的發酵物接到下一個發酵規模進行生產即可。這樣，能夠保證接入生產罐的發 酵物中沒有噬菌體，保證生產罐的正常生產。
[0046] 起始模板拷貝數的選擇主要是為了將得到的樣本檢測的范圍囊括，因此，根據待 測樣本，可選擇設置不同的起始模板的拷貝數。
[0047] 進一步地，所述熒光定量PCR檢測采用TaKaRa公司的PremixExTaq?II定量PCR 試劑盒推薦的步驟進行。
[0048] 為了得到的檢測方法更靈敏和準確，并且減少成本，更優選地，所述熒光定量PCR 的反應體系為20y1-25y1，優選為20y1。
[0049] 優選地，所述熒光定量PCR檢測采用的PCR反應體系為：Taq酶溶液10y1、每種引 物各 0? 8yI(lOpmol/y1)、探針 0?