基因工程菊粉酶及其以菊芋為原料制備結晶果糖的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及一種基因工程菊粉酶的新型復合酶 制劑的尚效制備方法及其用于以姻芋為原料制造尚品質結晶果糖的技術。
【背景技術】
[0002] 果糖是葡萄糖的同分異構體，是糖類中化學活性最高的糖，但其甜度為蔗糖的1. 8 倍（葡萄糖甜度為蔗糖的〇. 8倍左右），在人體內的代謝比葡萄糖快，容易被機體吸收，且不 依賴胰島素，對血糖影響很小，適用于葡萄糖代謝及肝功能不全的患者補充能量，同時它還 具有促進益生菌繁殖，改善腸功能和代謝，不致齲齒等特性。因其具有低熱量性，不引起血 糖升高，不刺激胰島素分泌，與脂肪同食，可抑制人體脂肪的過量儲存，以及抑制齲齒，促進 鈣的吸收等特性成果了高端食用糖產品，可廣泛應用于各類食品及醫藥保健品中。尤其是 結晶果糖，是糖尿病、心血管和肝臟病人良好的營養甜味品。
[0003] 目前國內市場上的果糖產品，主要以果葡糖漿等形式存在，高純度的結晶果糖由 于技術限制，價格較高，產量相對較少。近年來，大量的臨床科學研究的證實，高純度的結晶 果糖在人體代謝上有著獨特的功效。但結晶果糖作為一種重要的營養甜味劑，難以用于各 種食品配方中，原因是價格昂貴。其原因是我國果糖工業化生產技術尤其是結晶果糖生產 技術較落后，生產規模不大，在我國才剛剛起步。
[0004] 菊粉（Inulin)又稱菊糖，主要來源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子經 0 _2, 1糖苷鍵脫水聚合而成的線性直鏈多糖，其還原端含有一個葡萄糖殘基，呈直鏈結構， 聚合度通常在2~60,分子量為3000~5000碳單位，是一種功能性果聚糖和水溶性膳食纖 維。菊粉作為一種純天然的功能性食品配料，已被世界20多個國家批準為營養增補劑，廣 泛運用于乳制品、飲料、低脂低熱量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中國衛生部批準 菊粉為新資源食品。
[0005]目前報道產菊粉酶的微生物包括魯維酵母屬、海洋酵母屬、青霉屬、曲霉屬、芽孢 桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、節桿菌屬、放線菌屬等，其中產菊粉酶的微生物主要集中在酵母 菌屬、青霉屬和曲霉屬。但是通過野生型篩選、理化誘變和工藝條件優化的手段得到的菊粉 酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途徑之一。利用生物信息學技術 獲得菊粉酶基因inul和inull的結構和氨基酸序列，將其高效表達于基因工程酵母菌中， 實現菊粉酶的高效表達。
[0006]目前結晶果糖在工業上的生產方法按原料來源有三種：（1)以蔗糖為原料，經過 水解得到果葡糖液（其中果糖含量為46%~50% )，經色譜分離，將果糖和葡萄糖分開，得 到高純度的果糖液（果糖含量90%以上），將高純果糖經過離子交換和濃縮結晶，得到結晶 果糖。（2)以玉米淀粉生成葡萄糖為原料，通過葡萄糖異構酶進行異構化反應，得到果葡糖 液（其中果糖含量為42%左右），經色譜分離，將果糖和葡萄糖分開，得到高純度的果糖液 (果糖含量90%以上），再將高純度果糖液經過離子交換和濃縮結晶，得到結晶果糖。（3)以 菊糖為原料，將菊糖經過水解得到100 %果糖液，將果糖液經過離子交換濃縮結晶，得到結 晶果糖。前兩種生產方法實質上很相似，但是結晶果糖產率都很低，一般為葡萄糖或蔗糖投 料量的20%~26%，生產結晶果糖后的大量葡萄糖組分及果糖母液無法得到有效的利用， 造成生廣成本尚。故米用第二種方法可以提尚尚價值結晶果糖廣品的廣率，從而大幅提尚 經濟效益，是目前果糖生產工藝研究、開發和改革的主要內容，對促進我國結晶果糖研究和 國民經濟發展具有重要的意義。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種新型復合酶制劑的高效制備方法及其用于以菊芋為原 料制備尚品質結晶果糖的技術。
[0008] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0009] 首先本發明提供一種重組基因工程菌，所述重組菌包含核苷酸序列如SEQID NO: 1所示的菊粉酶基因inul和核苷酸序列如所示SEQIDNO: 2所示的菊粉酶基因inull， 以及上述基因在同一宿主細胞中的串聯表達。
[0010] 進一步地，本發明所用的宿主細胞可以是畢赤酵母、枯草芽胞桿菌、谷氨酸棒桿 菌、大腸桿菌、地衣芽胞桿菌、釀酒酵母或黑曲霉中的一種，優選畢赤酵母或釀酒酵母。
[0011] 進一步地，本發明提供一種以畢赤酵母菌為宿主細胞的a:優先表達菊粉酶I的重 組酵母菌，或b:優先表達菊粉酶II的重組酵母菌，或c:無序表達菊粉酶I和菊粉酶II的 重組酵母菌。
[0012] 更進一步地，本發明提供一種以畢赤酵母菌GSl15為宿主細胞，以質粒PPIC9K為 表達載體的a:優先表達菊粉酶I的重組酵母菌P.pastorisGS115/pPIC9K-inuI-inuII，或 b:優先表達菊粉酶II的重組酵母菌P.pastorisGS115/pPIC9K-inuII_inuI，或c:無序表 達菊粉酶I和菊粉酶II的重組酵母菌P.pastorisGS115/pPIC9K_inuI/inuII。
[0013] 進一步地，本發明還提供由上述重組酵母菌發酵生產的重組菊粉酶及其發酵制備 方法。
[0014] 進一步地，本發明提供一種新型復合酶制劑及其高效制備方法，由上述重組酵母 菌分別發酵生產的重組菊粉酶中至少兩種進行合理復配而成。
[0015] 更進一步地，新型復合酶由上述a、b、c三種重組菌中至少兩種菌所生產的重組菊 粉酶按照酶活比為1-10:10-1或1-10:1-10:1-10復配而成。
[0016] 進一步地，本發明提供一種利用上述重組菊粉酶或復合酶制劑以菊芋為原料生 產高品質結晶果糖的方法，包括菊粉酶的酶解催化方法、葡萄糖的高效分離方法和高效分 解或代謝方法。具體包括步驟如下：將菊芋經過干燥粉碎、打漿、水浴浸提、除雜脫色得到 浸提液，調節pH3. 8~7. 9,按每kg菊芋添加權利要求7所述復配酶總酶活650000~ 2000000U，控制溫度在20~80°C，攪拌速度在150~200r/min的條件下反應4~12h，當 寡聚糖全部酶解為單糖時，停止反應，進一步按水解液中的每kg葡萄糖添加1000~9000U 的葡萄糖氧化酶，再加入葡萄糖當量的Ca2+，沉淀去除葡萄糖，再將水解物進行濃縮結晶。利 用上述方法可以制備出100%含量的結晶果糖產品。
[0017] 本發明的有益效果主要體現在：
[0018]本發明中所使用的新型復合酶制劑具備高效酶解菊芋直接形成果糖的特點，且所 使用的新型復合酶制劑的制備方法可以獲得催化活性顯著的復合酶。
[0019] 本發明新型復合酶制劑的制備方法，特別是兩個或兩個以上關鍵酶的串聯表達方 法可以充分利用兩種酶共同作用時的高效性彌補單一酶作用時催化活性不高的不足。
[0020] 本發明新型復合酶制劑的制備方法，特別是兩個或多個關鍵酶的合理復配可以充 分利用酶促反應的動力學特性，大幅度提升菊芋作為原料直接水解為果糖的效率。
[0021] 本發明所涉及的菊芋為原料制備結晶果糖的技術包括了副產物葡萄糖的有效去 除方法，保證了結晶果糖的高品質。
[0022] 本發明形成的結晶果糖的酶解工藝是一種新工藝，采用該工藝制備結晶果糖具有 一次性加酶、工藝簡單等特點，可以大大降低操作難度，節約經濟成本。
[0023] 本發明尚品質結晶果糖的制備工藝，可以實現10噸到30噸及更大規_旲的尚品質 結晶果糖的高效制備過程。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :菊粉酶I和菊粉酶II的串聯表達方式；
[0025] 圖2.:結晶果糖產品的成分分析；
[0026] 圖3.:結晶果糖的制備工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段 均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的 范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本 發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發明的保護范圍。
[0028] 實施例中涉及到的培養基配方（單位為w/v)如下：
[0029] (I)LB液體培養基：蛋白胨1 %，酵母提取物0. 5%，NaCl1 %，其余為水，pH7. 0。
[0030] (2)PDA培養基：馬鈴薯200g切小塊，煮沸后再煮30min，紗布過濾后定容IL使用。 使用時按葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L加入。
[0031](3)YH)培養基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，其余為水，制作平板 時加入2%的瓊脂粉。121°C高壓滅菌20min。用于篩選G418抗性時加入G418至終濃度為 0? 25mg/mL~2.Omg/mL，即YPD-G418 平板。
[0032] (4)MD培養基：YNBL34%，生物素4X10 5%，葡萄糖2%，瓊脂2%，其余為水。
[0033] (5)BMGY培養基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，生物素4X10 5%，甘 油1%，磷酸鉀溶液100mmol/L，其余為水。
[0034] (6)BMMY培養基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，YNBL 34%，生物素4X10 5%，甲 醇0. 5%，磷酸鉀溶液100mmol/L，其余為水。
[0035] (7)8311培養基組成&/1):磷酸（85%)2.67111171，硫酸鈣1.18，硫酸鉀18.2，硫酸 鎂7. 27,氫氧化鉀4. 13,甘油（50% )40. 0,其余為水。
[0036] 實施例中涉及到的百分號" ％ "，若未特別說明，指質量百分比，溶液的百分比指 IOOrnl中含有溶質的克數，液體之間的百分比，是指在25°C時溶液的體積比例。
[0037] 首先通過五種表達方式獲得五種重組酶（I，II，III，IV，V)。