一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫學 檢測領域。
【背景技術】
[0002] 苯噻氰（TCMTB)是一種十分經濟、有效的綠色殺菌劑，它與美國Buckmam公司的 BUSAN30L，法國Progiven公司的BIOCIDEMT30均屬同一類產品，它能有效地應用于種子處 理，對存在的主要細菌、真菌和藻類都有極強的滅殺和控制作用，對于種子拌種、浸種和噴 霧治療炭疽、稻瘟、猝倒、立枯和柑橘潰瘍等病害有特效，因此，苯噻氰及其代謝產物在植物 與土壤都有較大的殘留。
[0003] 目前檢測苯噻氰的方法主要有氣相色譜法（GC)，液相色譜法（HPLC)，分光光度 法、電化學測定法、氣質聯用法等方法。但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺 點，不能實現大量樣品的快速檢測，因此建立一種快速簡便的苯噻氰檢測方法具有重要意 義。酶聯免疫法（ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要 求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。然而得到高特異性和高靈敏度的 單克隆單體是免疫學檢測的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗 體對苯噻氰具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立苯噻氰的免疫學檢測方法。
[0005] 本發明的技術方案，一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株，其命名為1B2,已保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 10862。
[0006] 所述苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株1B2的制備，步驟為： 1) 完全抗原的合成： A液的制備：稱取28. 6mgTCMTB類似物2-苯并噻唑硫代乙酸BTAC，EDC(碳二亞胺） 38. 3mg，NHS(N-羥基琥珀酰亞胺）23.Omg，用ImL無水DMF溶解，稱為A液，室溫攪拌反應 8h； B液的制備：稱取BSA(牛血清蛋白）112mg溶于20mLpH7. 4的0? 01mol/LPBS中，得 至IjB液； 在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應過夜，得到偶聯物BTAC-BSA混合液即 為苯噻氰完全抗原，通過透析分離完全抗原和未偶聯的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃 描方法鑒定； 2) 小鼠的免疫： 苯噻氰完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第 一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑；首免與加強免之間間隔一個月，加 強免3次，加強免之間間隔21天；最后用苯噻氰完全抗原，不含佐劑，沖擊免疫；通過間接 ELISA檢測血清效價和抑制； 3) 細胞融合與細胞株建立： 通過聚乙二醇PEG4000法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養基培 養，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑 制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交 瘤細胞株1B2; 4) 雜交瘤細胞株性質的鑒定：通過ELISA法測定靈敏度和特異性。
[0007] 通過苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株1B2分泌產生苯噻氰單克隆抗體。
[0008] 將苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株1B2通過體內腹水制備的單克隆抗體應用于 食品接觸相關材料中苯噻氰的快速檢測，具體步驟如下： (1) 包被：將包被原TCMTB-0VA用0. 05MpH9. 6碳酸鹽緩沖液從2Pg/mL開始倍比稀 釋，100ML/孔，37°C反應 2h; (2) 洗滌：將酶標板內溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min; (3) 封閉：拍干后，加入200ML/孔封閉液，37°C反應2h;洗滌后烘干備用； (4) 加樣：將抗血清從1:1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，100ML/ 孔，37°C反應Ih;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100ML/孔，37°C反應 Ih； (5) 顯色：將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入100ML的TMB顯色液，37°C避光反應 15min； (6) 終止和測定：每孔加入50ML2MH2SO4終止液以終止反應，然后用酶標儀測定各孔 的OD45。值； (7) 結果判讀：以OD45。值大于或等于陰性對照孔的2. 1倍，即P/N彡2. 1，所對應的血 清最高稀釋倍數即為血清的ELISA效價； (8) 標準曲線：配置0，1，2, 5,10, 20, 50,IOOyg/L苯噻氰標準溶液，采用間接競爭 ELISA繪制標準曲線，其IC5。為7yg/L。
[0009] 溶液的配置如下： 碳酸鹽緩沖液CBS:稱取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2. 93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加 雙蒸水至約800mL混勻，調pH值至9. 6,加雙蒸水定容至lOOOmL，4°C貯存備用； 磷酸鹽緩沖液PBS:8. 00gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2PO4, 2.9gNa2HPO4* 12H2O,溶 于800mL純水中，用NaOH或HCl調pH到7. 2~7. 4,定容至1000 mL; PBST:含 0? 05% 吐溫-20 的PBS; TMB顯色液：A液：Na2HPO4 ? 12H20 18. 43g，檸檬酸 9. 33g，純水定容至 1000mL;B液： 60mgTMB溶于IOOmL乙二醇中；A、B液按1 : 5體積比混合即為TMB顯色液，現用現混。
[0010] 本發明的有益效果：本發明獲得的抗苯噻氰單克隆抗體細胞株，對苯噻氰有較好 的檢測靈敏度和特異性（IC5。值為7yg/L)。
[0011]生物材料樣品保藏：一株苯噻氰單克隆抗體雜交瘤細胞株1B2,已保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號 院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 10862,保藏日期2015年5月19 曰。
【附圖說明】
[0012] 圖1是1B2單克隆抗體的抑制標準曲線。
【具體實施方式】
[0013] 本發明下面的實施例僅作為本
【發明內容】
的進一步說明，不能作為本發明的限定內 容或范圍。下面通過實施例對本發明作進一步說明。
[0014] 本發明通過將苯噻氰完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養基培養， 通過間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細胞上清，最終得到了對苯噻氰有較好特異性和靈 敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0015] 實施例1雜交瘤細胞株1B2的制備 (1) 完全抗原的合成 稱取28. 6mgTCMTB類似物2-苯并噻唑硫代乙酸（BTAC)，EDC(碳二亞胺）38. 3mg，NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)23.Omg，用ImL無水DMF溶解(稱為A液)，室溫