一種腫瘤抗原誘導的dc-cik細胞的制備方法及應用
【技術領域】 [0001] 本發明涉及生物，尤其涉及一種腫瘤抗原誘導的DC-CIK細 胞的制備方法及應用。
【背景技術】 [0002] DC細胞是"DendriticCells"的縮寫，中文全稱為"樹突狀細胞"，因 其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC細胞是由2011年諾貝爾獎獲得者、加拿 大籍科學家RalphM.Steinman于1973年發現的，是目前發現的功能最強的抗原遞呈細胞 (AntigenPresentingCells,APC)。已證實，DC細胞是唯一能夠顯著刺激初始T細胞增殖 的APC，而其它APC(如單核巨噬細胞，B細胞等）僅能刺激已活化的或記憶性的T細胞。DC 細胞是機體適應性T細胞免疫應答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。
[0003]CIK細胞是"Cytokine-InducedKillerCells"的縮寫，中文全稱為"細胞因子誘 導的殺傷細胞"。CIK細胞是單個核細胞在⑶3單抗和多種細胞因子（包括IFN-y，IL-2 等）的作用下培養獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應細胞的異質細胞群，其既具有T 淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞（自然殺傷細胞）的非MHC(主要組織相容性 抗原）限制性腫瘤殺傷能力。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外 可高度擴增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。
[0004] DC細胞與CIK細胞具有協同作用，共同孵育后，DC細胞表面共刺激分子的表達及 抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK細胞的增殖能力和體內外細胞毒活性也得以增強，因此 DC-CIK較單獨的DC或CIK治療更為有效。
[0005] 雖然通過常規培育方法獲得的DC-CIK細胞治療較單獨的DC或CIK細胞治療更為 有效，但是通過目前培育方法獲得DC-CIK細胞只具有非特異性的腫瘤殺傷能力。
[0006]
【發明內容】
為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種治療效果好，且 具有特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用的腫瘤抗原誘導的DC-CIK細胞的制備方法及應 用。
[0007] 本發明的技術方案為：
[0008] -種腫瘤抗原誘導的DC-CIK細胞的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0009] 步驟1、采用血細胞分離機采集腫瘤患者自體外周血單個核細胞，用0. 9%生理鹽 水洗滌后，采用無血清A頂-V培養基調節細胞密度至1~2XIO6個/mL;
[0010] 步驟2、將細胞接種于培養瓶，并將培養瓶置于37°C、5%CO2培養箱孵育2小時后， 收集貼壁細胞及懸浮細胞；
[0011] 步驟3、將貼壁細胞置于培養瓶中，并加入DC誘導培養液，然后將培養瓶置于 37°C、5%CO2培養箱中誘導，第3天補加DC誘導培養液，第5天加入腫瘤特異性抗原，第6 天加入TNF-a誘導DC成熟，第7天收獲具有腫瘤特異性抗原的成熟DC細胞；
[0012] 步驟4、將懸浮細胞重懸于無血清A頂-V培養基中，調整細胞密度至1~2XIO6個 /mL，并添加終濃度為lOOOU/mL的IFN-y，然后將培養基置于37°C、5% 0)2培養箱中孵育， 第2天添加5 %的自體血漿、終濃度為lOOU/mL的IL-Ia、終濃度為lOOOU/mL的IL-2、終濃 度為〇. 5yg/mL的⑶3單抗，培養至第5天，補充添加含有IL-2濃度為lOOOU/mL的無血清 AM-V培養基；第7天收獲CIK細胞；
[0013] 步驟5、將收獲的具有腫瘤特異性抗原的成熟DC細胞和CIK細胞混合培養，得到 DC-CIK細胞。
[0014] 本發明米用上述的制備方法，在步驟1中米用無血清AIM-V培養基，與現有米用胎 牛血清培養基相比，避免培養的DC-CIK細胞出現異源血清殘留，在細胞回輸治療過程中， 對患者產生嚴重的免疫反應；實現安全培養DC-CIK細胞。
[0015] 在步驟4中，加入自體血漿進行培養，可以更加有利于自體CIK細胞的增值和分 化。
[0016] 在步驟3中，加入腫瘤特異性抗原對DC細胞誘導，可快速擴增獲得大量具有非特 異性腫瘤殺傷活性的DC-CIK細胞，同時賦予DC-CIK細胞特定腫瘤的殺傷活性，使DC-CIK 細胞對特定腫瘤殺傷活性更強。
[0017] 優選的，所述步驟3中，所述DC誘導培養液含rhGM-CSF100ng/mL、rhIL-4 50ng/ mL〇
[0018] 優選的，所述步驟3中加入的腫瘤特異性抗原終濃度為20yg/mL。
[0019] 優選的，所述步驟3中加入的TNF-a終濃度為500U/mL。
[0020] 更優選的，所述步驟3具體為：將貼壁細胞置于培養瓶中，并加入DC誘導培養液， 所述DC誘導培養液含rhGM-CSFlOOng/mL、rhIL-4 50ng/mL，然后將培養瓶置于37°C、5% CO2培養箱中誘導，第3天補充添加DC誘導培養液，第5天加入終濃度為20yg/mL的腫瘤 特異性抗原，第6天加入終濃度為500U/mL的TNF-a誘導DC成熟，第7天收獲具有腫瘤特 異性抗原的成熟DC細胞。
[0021] 優選的，所述步驟5為：第7天將收獲的帶有腫瘤特異性抗原的DC細胞加入到CIK 細胞懸液中，CIK細胞與DC細胞按數量比10:1的比例混合培養，此后每2-3天補加含有 IL-2濃度為lOOOU/mL的無血清A頂-V培養基，共培養5天后得到DC-CIK細胞。
[0022] 更為具體的，本發明所述的腫瘤抗原誘導的DC-CIK細胞的制備方法，其包括以下 步驟：
[0023] 步驟1、采用血細胞分離機采集腫瘤患者自體外周血單個核細胞，用0. 9%生理鹽 水洗滌后，采用無血清A頂-V培養基調節細胞密度至1~2XIO6個/mL;
[0024] 步驟2、將細胞接種于培養瓶，并將培養瓶置于37°C、5%CO2培養箱孵育2小時后， 收集貼壁細胞及懸浮細胞；
[0025] 步驟3、將貼壁細胞置于培養瓶中，并加入DC誘導培養液，所述DC誘導培養液含 rhGM-CSFlOOng/mL、rhIL-4 50ng/mL，然后將培養瓶置于37°C、5%CO2培養箱中誘導，第 3天進行補加DC誘導培養液，第5天加入終濃度為20yg/mL的腫瘤特異性抗原，第6天加 入終濃度為500U/mL的TNF-a誘導DC成熟，第7天收獲具有腫瘤特異性抗原的成熟DC細 胞；
[0026] 步驟4、將懸浮細胞重懸于無血清A頂-V培養基中，調整細胞密度至1~2XIO6個 /mL，添加終濃度為lOOOU/mL的IFN-y，然后將培養基置于37°C、5%CO2培養箱中孵育，第 2天添加5%的自體血漿、終濃度為lOOU/mL的IL-Ia、終濃度為lOOOU/mL的IL-2、終濃度 為0. 5yg/mL的⑶3單抗，培養至第5天補加含有IL-2濃度為lOOOU/mL的無血清A頂-V 培養基；第7天收獲CIK細胞；
[0027] 步驟5、第7天將收獲的帶有腫瘤特異性抗原的DC細胞加入到CIK細胞懸液中， CIK細胞與DC細胞按數量比10:1的比例混合培養，此后每2-3天補加含有IL-2濃度為lOOOU/mL的無血清A頂-V培養基，共培養5天后得到DC-CIK細胞。本發明還提供了 一種腫 瘤抗原誘導的DC-CIK細胞的應用，所述腫瘤抗原誘導的DC-CIK細胞應用于制備抗腫瘤藥 物。
[0028] 本發明的制備方法制備的DC-CIK細胞增殖活性高，其增殖倍數平均高達 229. 85± 1. 31，是傳統方法獲得的DC-CIK增殖倍數的2. 4倍，具體數值參見表1。同時，本 發明加入腫瘤特異性抗原對DC細胞誘導，賦予DC-CIK細胞特定腫瘤的殺傷活性，使DC-CIK 細胞對特定腫瘤殺傷活性更強，最高可以提高腫瘤殺傷活性20%~40%。本發明將受到不 同腫瘤抗原刺激的DC細胞，在和CIK細胞共培養后可以明顯促進DC-CIK細胞的成熟，而且 可以大大提高DC-CIK細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷能力。在DC-CIK回輸30天后，腫瘤患 者T淋巴細胞和NK細胞均顯著升高，病情得到明顯改善。因此，負載特異抗原的DC-CIK細 胞可以用于相關抗腫瘤藥物的應用。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明DC-CIK細胞的制備流程圖。
【具體實施方式】 [0030] 下面結合對本發明作進一步詳細的說明。
[0031] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明了，下面結合【具體實施方式】并參 照附圖，對本發明進一步詳細說明。應該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發 明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對公知技術的描述，以避免不必要地混淆本發明的 概念。
[0032] 本發明提供一種腫瘤抗原誘導的DC-CIK細胞的制備方法，所述制備方法包括以 下步驟：
[0033] 步驟1、采用血細胞分離機采集腫瘤患者自體外周血單個核細胞，用0. 9%生理鹽 水洗滌后，采用無血清A頂-V培養基調節細胞密度至1~2XIO6個/mL;
[0034] 步驟2、將細胞接種于培養瓶，