miR-21反義核苷酸修飾的骨髓間充質干細胞的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及成體干細胞領域，通過特異性反義核苷酸序列沉默間充質干細胞 (mesenchymalstemcell，MSCs)中內源性miR-21的表達水平增強了MSCs的免疫調節能 力，并研究修飾后的MSCs用途。
【背景技術】
[0002] 傳統概念中骨髓間充質干細胞等MSCs首次分離后被證明在不同的誘導環境下可 以分化為骨、軟骨、脂肪、胰島、肝臟和神經等不同組織細胞，是目前治療骨骼疾病最常用的 種子細胞，但隨著體外培養時間的延長，其移植回體內后成骨能力明顯下降，而且其多向分 化能力也逐漸丟失。此外研究表明骨髓間充質干細胞能夠通過抑制多種免疫細胞如樹突狀 細胞，T淋巴細胞，B淋巴細胞的功能，發揮重要的免疫調節作用。臨床上MSCs被運用到全 身，治療各種系統性疾病，如糖尿病，類風濕性關節炎，干燥綜合征等，在機體免疫調控中發 揮著重要作用。但是尚需要開發輸注細胞的新途徑，目前通過靜脈輸注細胞的方法。其所 面臨的問題就是植入效率不均一，對有些病例不能產生明顯和持久的治療作用。此外，隨著 體外培養的時間延長，MSCs也會喪失部分的生物學活性，降低應用效率。越來越多的課題 組都開始意識到重新尋找構建一種提高MSCs的植入效率的重要性，使其產生更加明顯和 持久的治療作用。
[0003] 微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類參與基因轉錄后水平調控的小分子、非編 碼的單鏈RNA，長度19~25nt，與細胞的生長轉歸有密切關系，能調控細胞增殖、分化等。 miRNAs介導特異性的基因沉默或激活靶mRNA而影響蛋白質合成，調控轉錄后水平的基因 表達，現已證明miRNAs能夠調控多種生理學和病理學過程[8-10]。miRNAs具有高度的生物 進化保守性、組織特異性、基因簇集現象、時空特異性等生物學特性[11]。miRNAs通過RNA 干擾途徑降解靶mRNA;動物中miRNAs與靶mRNA的3'-不翻譯區部分序列反向互補結合， 與RNA干擾不同的是，革ElmRNA的穩定性不受影響，而翻譯起始后受抑制。因此，通過miRNAs 的特異性互補反義鏈可以改變細胞中miRNA的表達水平，增加靶基因的轉錄后水平從而改 變細胞的增殖，分化能力。
[0004]目前可通過在細胞中使用脂質體轉染的方式特異沉默細胞內內源性miRNA的表 達水平。此種改變miRNA表達的基因修飾方式與傳統的基因修飾相比有：不需要病毒載體， 解決了病毒在體內的不可控性的問題；轉染效率高；易操作等特點。通過在細胞中使用脂 質體轉染miRNA的特異反義鏈可高效地沉默細胞內miRNA的內源性表達。在本課題組的研 究中發現，miR-21的表達水平負向調控MSCs中轉換生長因子-0I(transforminggrowth factor-0 1，TGF-0 1)的表達水平。TGF-0 1作為一種免疫抑制劑可以抑制免疫活性細 胞的增殖和抑制淋巴細胞增殖，從而影響MSCs的免疫調節能力。因此本
【發明內容】
為利用 miR-21反義鏈轉染MSCs增強細胞分泌TGF-1的能力，進而持續增強MSCs的免疫調節能 力。之后再將miRNA反義鏈修飾過的MSCs應用到干細胞治療效果不明顯或者無效的系統 性疾病中，提高干細胞在有效時間內對于系統性疾病的治療效果。
【發明內容】
[0005] 發明目的
[0006] 1)提出一種簡便、成本低廉、不需要病毒載體且對人體無毒副作用的干細胞修飾 方法；
[0007] 2)提出經上述修飾后的干細胞的制備方法；
[0008] 3)提出經上述修飾增強干細胞免疫調節能力特性的優化方法；
[0009] 4)提出經修飾后的干細胞可能治療的臨床疾病。
[0010] 發明思路
[0011]anti-sense-miRNA作為相應miRNA的完全互補鏈，均是經2' 甲基穩定性化 學修飾的小RNA分子。可以通過與對應miRNA特異性相互作用，促進該miRNA的降解，從而 實現對特定miRNA功能的抑制，阻斷miRNA在細胞中的作用。通過前期研究發現miR-21能 夠負向調節MSCs的免疫調節能力。因此本專利內容欲通過脂質體轉染的方式將miR-21的 反義鏈miR-21inhibitor轉染進入細胞，特異性沉默細胞中miR-21的表達水平，阻斷細胞 內miR-21下游通路來提高MSCs的免疫調節能力。因此如何將這種核苷酸序列導入細胞的 方式將是一個重要的考慮內容。另外導入miR-21inhibitor的濃度也是需要謹慎選擇的， 最佳的濃度下才可以起到最佳的效果，最后找到修飾后干細胞的制備方法及應用的適應癥 都是本發明專利的內容。
[0012] 本發明的有益效果
[0013] 1.本發明所制備的干細胞方法簡便、快捷、產品無害。
[0014] 鏡下觀察發現，本發明制備的MSCs維持了基本的細胞形態，保持了細胞間連接， 并且保存了細胞外基質連接形成的支架，未破壞細胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能轉 染miR-21inhibitor對干細胞的增殖和凋亡沒有影響，說明轉染miR-21inhibitor對MSCs 沒有細胞毒性。
[0015] 2.本發明所制備的干細胞產品生物學性能穩定，通過在體外對其性能的優化并篩 選，明確所制備的產品具有更顯著的免疫能力
[0016] 從基因水平檢測發現，在轉染后一周時間內人MSCs、小鼠BMMSCs均可穩定地維持 沉默miR-21的表達效應，而且可持續大幅度提高細胞對TGF-P1的分泌水平；同時通過與 T細胞共培養可促進T細胞向調節性T細胞（regulatoryTcells，Tregcells)分化比例。 即本發明所制備的干細胞產品增強了干細胞的免疫調節能力。
[0017] 3.本發明所涉及的干細胞產品與不修飾的細胞相比在小鼠體內炎性環境下，對自 身免疫病及免疫紊亂等系統性免疫疾病具有更加持久和明顯的效果。
[0018] 在小鼠體內用藥物誘導腸炎后，通過尾靜脈輸入miR-21inhibitor修飾后的 BMMSCs，發現輸入轉染miR-21inhibitorBMMSCs組的治療效果明顯優于轉染對照組及不 轉染組，且改善血清免疫學相關指標，恢復體內免疫。即本發明所制備的干細胞產品在體內 具有更明顯的治療效果。
[0019] 具體實驗數據和說明見實施例部分。
【附圖說明】
[0020] 1.圖1為實施例I:實驗中所使用干細胞生物學特性鑒定；
[0021] 2.圖2為實施例2 :在細胞中miR-21轉染試劑及轉染濃度篩選；
[0022] 3.圖3為實施例3 :miR-21沉默最佳轉染濃度篩選制備miR-21inhibitor-MSCs的 方法；
[0023] 4.圖4為實施例4:轉染miR-21inhibitor不影響小鼠BMMSCs的增殖和凋亡；
[0024] 5.圖5為實施例5 :miR-21負向調控中細胞內TGF-f3 1的表達水平；
[0025] 6?圖6為實施例6 :miR-21負向調控BMMSCs的免疫調節能力；
[0026] 7.圖7為實施例7 :TGF-P1抗體可中和miR-21調控BMMSCs免疫調節能力效應；
[0027] 8.圖8為實施例8 :miR-21沉默BMMSCs能夠更加有效治療DSS誘導的小鼠實驗 性腸炎；
[0028] 9.圖9為實施例9 :miR-21沉默BMMSCs上調腸炎小鼠血清TGF-P1及下調IL-17 水平。
【具體實施方式】
[0029] 細胞培養
[0030] 實驗材料健康人骨髓來自于外傷或正頌外科需要腓骨移植患者，健康人牙周組 織來自于因正畸需要無感染的前磨牙或第三磨牙，健康人乳牙牙髓組織來自于臨床因滯留 而需要拔除的乳牙。
[0031] 1.人牙源性MSCs的培養
[0032] 人牙髓干細胞培養
[0033] 新鮮拔除的牙齒立即放入裝有無菌PBS和抗生素的離心管，在12小時內分離培養 牙髓干細胞。用無菌紗布包裹牙齒硬組織，并用酒精浸泡消毒過的錘子敲打并敲開牙體獲 得牙髓組織，用PBS反復清洗，盡量剪碎，置含3mg/mlI型膠原酶和4mg/mlDispase溶液 中，37°C水浴消化0. 5-1小時，過70ym細胞篩收集細胞，1000 rpm離心lOmin，用