一株海洋細菌及其產生的胞外多糖的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株海洋細菌，尤其是涉及一株海洋細菌及其產生的胞外多糖。
【背景技術】
[0002] 細菌普遍合成分泌胞外多糖。胞外多糖是細菌的次級代謝產物，是細菌生長過 程中分泌到細胞壁外形成與菌體分離的可溶性多糖復合物。海洋細菌因其獨特的生活 環境，分泌的胞外多糖常常具有特殊結構，因此，海洋細菌生產的胞外多糖在生物技術 領域中具有極大的潛在應用價值。已有一些胞外多糖生產菌從不同的海洋環境中被分 離，例如從深海熱液泉口，海洋火山和熱液區，以及淺海海底溫泉發現了豐富的胞外多糖 生產菌（P〇li，2010)。從淺海熱泉分離出的Bacillus屬的菌株產生的多糖可以抗病毒 (Gugliandolo,2014)。從北極海冰中分離的Pseudoalteromonas細菌合成的多糖具有抗 凍特性（GugliandoloC,SpanoA,LentiniV,ArenaA,MaugeriTL. 2014,Antiviraland immunomodulatoryeffectsofanovelbacterialexopolysaccharideofshallow marineventorigin.JApplMicrobiol. 116(4):1028-34)〇
[0003] 近幾年，隨著對微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖產量的年增長量在 10%以上，而一些新型多糖年增長量在30%以上，現在世界上每年多糖總需求量在100萬 噸以上，總價值50~100億美元。因此，多糖的生產具有巨大的市場價值。然而，當前被 應用于實際生產中的細菌多糖非常有限。因此，有必要篩選、分離新的多糖產生菌，并對 它們所產多糖的結構、物理化學特性進行深入探究，以進一步拓展它們的應用領域。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一株海洋細菌AlteromonasemarinaP2-B12。
[0005] 本發明的另一目的在于提供一株海洋細菌AlteromonasemarinaP2-B12制備具 有新穎結構并安全無毒的胞外多糖的方法。
[0006] 所述一株海洋細菌AlteromonasemarinaP2-B12,已于2015年08月07日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3 號中國科學院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo. 11180。
[0007] 本發明的海洋細菌AlteromonasemarinaP2-B12是從海水樣品中分離得到的，海 水采集于2012年8月，經度115°E，煒度18°N，水深75m;將采集的海水IOOyL吸取涂 布于平板，放置室溫培養。待培養3天后，隨機從平板上挑取形態大小不同的菌落進行純化 培養。純化時用接種環挑取菌落，在平板表面進行劃線，觀察平板上菌株的顏色、大小、形 態是否相同.挑取不同的菌落劃線分離，直到分離出單一形態的菌落為止。通過苯酚-硫 酸法對所得菌株培養上清液是否產多糖進行檢測，初篩多糖產量超過l〇〇mg/L，得到該產 多糖菌株。該菌株的特征為：AlteromonasemarinaP2-B12為革蘭氏陰性菌，長桿狀，在 2216E固體培養基菌落較大（直徑2_)，乳白色，圓形，隆起，邊緣較圓整，不透明，無迀移 性。
[0008] 本發明通過DNA序列分析確定了其種屬關系，屬于交替單胞菌屬Alteromonase。 該菌株16SrRNA序列見說明書最后部分。
[0009] 所述一株海洋細菌Alteromonase marina P2-B12制備胞外多糖的方法，具體步驟 如下：
[0010] 1)菌株培養
[0011] 以工業葡萄糖為單一碳源添加到人工海水里進行培養，培養基的具體配方為 (IL):葡萄糖10. 〇g/L、氯化鈉19.Og/L、氯化氨0. 3g/L、磷酸氫二鉀0. 4g/L、氯化鉀0. 3g/ L、七水合硫酸鎂0. 5g/L、七水合氯化鈣0. 03g/L，pH7. 6 ;
[0012] 將Alteromonase marina P2-B12接種到培養基搖床培養，得種子培養液；
[0013] 另配制培養基，放入發酵罐中，滅菌，待溫度降到25°C，接入種子培養液培養，得 發酵液；
[0014] 2)多糖的提取及脫鹽
[0015] 將發酵液離心，取上清液，上清液過濾，濾液中加入無水乙醇，靜置過夜，然后將 粘稠的菌多糖移入離心管中，加入冰凍無水乙醇浸洗，將沉淀收集，凍干，即得菌多糖的提 取物，再溶解到水中，移入透析袋，將透析袋懸掛到水中，透析過夜，透析過的菌多糖溶液加 入冰凍乙醇再沉淀，凍干，透析除鹽后的菌多糖樣品即為多糖粗提物；
[0016] 3)分離純化
[0017] 利用離子交換層析對多糖粗提物進行純化，收集主峰，將收集到的主峰濃縮脫鹽、 冷凍干燥，即得海洋細菌胞外多糖。
[0018] 在步驟1)中，所述搖床培養的條件可為25°C，180rpm，搖床培養過夜；所述滅菌的 條件可為120°C滅菌30min;所述種子培養液的接種量按體積百分數可為1%;所述接入種 子培養液培養可為25 °C，500rpm/min培養94h。
[0019] 在步驟2)中，所述離心的條件可在8000rpm離心20min;所述過濾可采用0. 45ym 濾膜（MilliporeHAWP04700)過濾；所述濾液中加入無水乙醇可加入按體積比3倍濾液的 無水乙醇；所述靜置過夜的溫度可為4°C;所述將粘稠的菌多糖移入離心管可采用玻璃棒纏 取粘稠的菌多糖移入50mL離心管中；所述浸洗可加入質量百分濃度為75%的冰凍無水乙 醇浸洗3次；所述透析袋可采用直徑16mm，截留分子量3500道爾頓的透析袋；所述加入冰 凍乙醇再沉淀可加入按體積比3倍菌多糖溶液體積的冰凍乙醇再沉淀。
[0020] 在步驟3)中，所述離子交換層析的條件可為：層析柱規格為I. 6cmX30cm，凝膠類 型為DEAE-Sepharose Fast Flow，用0~2MNaCl進行梯度洗脫，流速為lmL/min。
[0021] 本發明制備所得的海洋細菌胞外多糖的分子量大于167kDa，海洋細菌胞外多糖由 鼠李糖（Rha)、甘露糖（Man)和半乳糖醛酸（GalA)以a-1，3和a-1，4鍵結合構成結構單 元（[-3]-a-Rhap-Q- 3)-a-Manp-(1 - 4)-a-GalAp-Q-))。該海洋細菌胞外多糖的 糖基組成和糖苷鍵連接方式與其它已報道的多糖都不相同，是一種新穎的胞外多糖。
【附圖說明】
[0022] 圖1為AlteromonasemarinaP2-B12透射電鏡圖。在圖1中，a的標尺為200nm， b的標尺為0. 2ym。
[0023] 圖2為基于16SrRNA的P2-B12進化樹分析。
[0024] 圖3為梯度洗脫收集得到的主峰示意圖。
[0025] 圖4為洗脫得到的洗脫峰示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0027] 實施例1菌株的獲得
[0028] 本發明的菌株是通過以下方法篩選得到的：海水采集于2012年8月，經度 115°E，煒度18°N，水深75m。將采集的海水100^吸取涂布于2216￡平板。2216已培 養基：蛋白胨5.Og,酵母膏I.Og,磷酸鐵0.Olg,瓊脂20.Og,人工海水10