一種生產β-胡蘿卜素的酵母菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于代謝工程和合成生物學領域，涉及一種生產0 -胡蘿卜素的酵母菌株 及其應用。
【背景技術】
[0002] (6-胡蘿卜素是類胡蘿卜素（Carotenoids)的一種，具有非常強的抗氧化性，可以 預防、延緩和治療某些疾病，尤其是癌癥，同時也能提高機體的免疫功能。目前被廣泛應用 于食品、藥品、化妝品和保健品行業，具有廣闊的市場前景。
[0003] 目前(6-胡蘿卜素的開發生產主要有天然提取、化學合成、微生物發酵等方法。相 比于前兩種生產方式，微生物發酵生產P_胡蘿卜素具有生產周期短，原料低廉易獲取，生 產成本低，安全性高，產物易純化等特點。
【發明內容】
[0004] 本發明的首要目的在于提供一種生產0 -胡蘿卜素的酵母菌株。
[0005] 本發明的另一目的在于提供上述生產(6-胡蘿卜素菌株的應用。
[0006] 本發明的再一目的在于提供利用上述菌株生產P_胡蘿卜素的方法。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0008] 一種生產-胡蘿卜素的酵母菌株，其基因組上的GAL1、GAL7和GALlO基因被 ERG12、tHMGl和ERG8基因替換掉；GAL80基因被MVDUERG10和IDIl基因替換掉；ERG9基 因的啟動子被tHMGl、ERG13基因和pCTR3啟動子替換掉；且含有能表達carG、carB和carRA 基因的真核表達質粒。所述的ERG12、tHMGl、ERG8、MVD1、ERG10、IDI1、ERG13、carG、carB 和carRA基因通過構建在半乳糖誘導的啟動子下實現超表達。所述的半乳糖誘導的啟動子 優選為GALUGAL7和GALlO基因的啟動子（pGALl、pGAL7和pGALlO)，這些啟動子在細胞生 長前期時不啟動，而在細胞生長后期時開始啟動基因表達，使用這些啟動子可以避免細胞 生長前期(6-胡蘿卜素的積累對細胞生長造成傷害。
[0009] 所述的酵母菌株優選為釀酒酵母CEN.PK2-1C。
[0010] 所述的GAL1、GAL7、GALlO和GAL80基因為釀酒酵母內涉及到半乳糖代謝和調控 相關的基因。其中，基因GALl編碼將D-半乳糖磷酸轉化為D-半乳糖-1-磷酸的半乳糖激 酶，基因GAL7編碼將D-半乳糖-1-磷酸轉化為D-葡萄糖-1-磷酸的半乳糖-1-磷酸轉尿 苷酰酶，基因GALlO編碼將尿苷二磷酸-半乳糖轉化為尿苷二磷酸-葡萄糖的尿苷二磷酸 葡萄糖異構酶，基因GAL80轉錄的蛋白和GAL4蛋白結合，阻止GAL4蛋白對半乳糖代謝相關 基因的轉錄激活作用。
[0011] 所述的ERG12、tHMGI、ERG8、MVDI、ERG10、ID11和ERG13基因為釀酒酵母內甲羥戊 酸途徑中相關的基因。其中，基因ERGlO編碼將兩分子乙酰輔酶A縮合為乙酰乙酰輔酶A 的乙酰輔酶A硫脂酶，基因ERG13編碼將乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合為HMG-CoA的 HMG-CoA合酶，基因tHMGl編碼將HMG-CoA還原為甲羥戊酸的HMG-CoA還原酶，基因ERG12 編碼將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的甲羥戊酸激酶，基因ERG8編碼將甲羥戊 酸-5-磷酸磷酸化為甲羥戊酸-5-焦磷酸的甲羥戊酸磷酸激酶，基因MVDl編碼將甲羥戊 酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊烯焦磷酸的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶，基因IDIl編碼將異戊烯焦 磷酸異構為二甲基烯丙基焦磷酸的異戊烯焦磷酸異構酶。
[0012] 所述的carG、carB和carRA基因為外源引入的(6-胡蘿卜素合成相關基因。其 中，基因carG編碼將異戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸縮合為櫳牛兒基櫳牛兒基焦 磷酸的櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶，基因carRA編碼的蛋白具有雙功能，將兩個櫳牛兒 基櫳牛兒基焦磷酸縮合為八氫番茄紅素的八氫番茄紅素合成酶功能和將番茄紅素環化生 成胡蘿卜素的番茄紅素環化酶功能，基因carB編碼將八氫番茄紅素脫氫生成番茄紅素 的八氫番前紅素脫氫酶。
[0013] 所述的甲羥戊酸途徑相關基因優選為來源于釀酒酵母INVSCl 的 ERGlO(3 291389 79:498096-499 29 2)、ERG13 (3 29138949:19060-20 5 3 5)、 tHMGl(3291389 49:1 15734-1 17239)、ERG12 (329138949:68446 7-685798)、 ERG8 (3291389 49:712316-713671)、MVDl(329138953:701895-7 03085)和 IDIl(329138979:327864-328730)。
[0014] 所述的P_胡蘿卜素合成相關的基因為經過密碼子優化的基因，優選以三孢布拉 霉（Blakesleatrispora)的carG(JQ28"95.l)、carB(AYl76663. 1)和carRA(AYl76663. 1) 基因為基礎進行密碼子優化得到的基因，經過密碼子優化的carG、carB和carRA基因的序 列如SEQIDNO. 9-11 所示。
[0015] 所述的生產P-胡蘿卜素的酵母菌株，優選通過包含如下步驟的方法制備得到：
[0016] (1)將以 p416GALl為骨架載體，包含 ERG12、tHMGl、ERG8、TRPl基因（TRPl基因編 碼蛋白的功能涉及到釀酒酵母中色氨酸的合成，該基因存在時可恢復營養缺陷型酵母CEN. PK2-1C色氨酸合成能力，用作質粒的篩選標記）和pGAL7、pGALlO、pGALl啟動子，序列如 SEQIDNO. 12所示的pXL141質粒（不含骨架載體序列）用XhoI酶切后轉化釀酒酵母CEN. PK2-1C，以色氨酸TRPl為篩選標記，篩選到攜帶所述基因和啟動子的片段同源重組后替換 掉CEN.PK2-1C基因組上GAL1、GAL7和GALlO基因的菌株XL151。在pXL141質粒上，基因 ERG12構建在啟動子pGAL7下，基因tHMGl構建在啟動子pGALlO下，基因ERG8構建在啟動 子pGALl下。
[0017] (2)將以p416GALl為骨架載體，包含MVDUERG10、IDIULEU2基因（LEU2基因編 碼蛋白的功能涉及到釀酒酵母中亮氨酸的合成，功能同TRPl)和pGAL7、pGALlO、pGALl啟 動子，序列如SEQIDNO. 13所示的pXL142質粒（不含骨架載體序列）用XhoI酶切后轉化 步驟（1)得到的菌株XL151，以亮氨酸LEU2為篩選標記，篩選到攜帶所述基因和啟動子的 片段同源重組后替換掉XL151基因組上GAL80基因的菌株XL152。在pXL142質粒上，基因 MVDl構建在啟動子pGAL7下，基因ERG10構建在啟動子pGALlO下，基因IDIl構建在啟動子 pGALl下。
[0018] (3)將以p416GALl為骨架載體，包含tHMGl、ERG13、HIS3基因（HIS3基因編碼蛋 白的功能涉及到釀酒酵母中組氨酸的合成，功能同TRPl)和pGAL10、pGALl、pCTR3啟動子， 序列如SEQIDNO. 14所示的pXL143質粒（不含骨架載體序列）用NcoI酶切后轉化步驟 (2)得到的菌株XL152,以組氨酸HIS3為篩選標記，篩選到攜帶所述基因和啟動子的片段同 源重組后替換掉XL152基因組上ERG9基因啟動子的菌株XL153。在pXL143質粒上，基因tHMGl構建在啟動子pGALlO下，基因ERG13構建在啟動子pGALl下。
[0019] (4)往菌株XL153中轉入能表達carG、carB和carRA基因的真核表達質粒得到生 產胡蘿卜素的酵母菌株。
[0020] 優選的步驟（4)為：將以p426GALl為骨架載體，包含carG、carB、carRA、URA3基 因（URA3基因編碼蛋白的功能涉及到釀酒酵母中組氨酸的合成，功能同TRPl)和pGAL7、 pGAL10、pGALl啟動子，序列如SEQIDNO. 15所示的pXL144質粒（不含骨架載體序列）轉 化步驟（3)得到的菌株XL153,以尿嘧啶URA3為篩選標記，篩選得到菌株XL154。在pXL144 質粒上，基因carG構建在啟動子pGALl下，基因carB構建在啟動子pGALlO下，基因carRA 構建在啟動子PGAL7下。
[0021] 上述生產P-胡蘿卜素的酵母菌株在生產P-胡蘿卜素中的應用。
[0022] 利用上述生產(6-胡蘿卜素的酵母菌株生產(6-胡蘿卜素的方法，包含如下步驟： 將上述生產(6-胡蘿卜素的酵母菌株接入含碳源的培養基中進行發酵得到(6-胡蘿卜素。 所述的碳源優選為葡萄糖、甘油或乙醇。
[0023] 所述的培養基優選為如下培養基中的一種：
[0024]SC-URA液體培養基：0.67%YNB，2%葡萄糖，缺尿嘧啶的氨基酸混合物；
[0025] YPD液體培養基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖；
[0026] YPDG液體培養基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，1%葡萄糖，1%甘油；
[0027] YPDE液體培養基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，1%葡萄糖，1%乙醇。
[0028] 更優選的，所述的培養基為YPDE液體培養基。
[0029] 本發明中涉及的培養基或溶液的％單位指每IOOmL培養基或溶液中含有該物質 多少g，如發酵培養基YPDE是指IOOmLYPDE培養基中含有蛋白胨2g、酵母提取物lg、葡萄 糖lg、乙醇lg。其他培養基或溶液亦然。
[0030] 所述的氨基酸混合物的配方如下表1:
[0031]
[0032] 缺尿嘧啶的氨基酸混合物即上述混合物中不含尿嘧啶，缺亮氨酸的氨基酸混合物 即上述混合