一種基于深孔板的衣康酸高產菌株的高通量篩選方法及菌株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物菌種篩選技術領域，尤其是一種基于原生質體誘變、深孔細胞 培養板的高通量篩選衣康酸高產菌株的方法。
【背景技術】
[0002] 衣康酸學名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸，是世界上第五大有機酸。由于分子內存 在一個不飽合雙鍵和兩個活潑的羧基，使得衣康酸能夠進行加成、聚合反應，形成聚合高 分子，其中尤其重要的是衣康酸的酯化反應。標準的酯化反應能夠產生衣康酸二酯，且產 率很高。衣康酸酯類是合成樹脂、塑料、增塑劑的重要原料；另外，衣康酸與胺類反應生成 的N-烴基吡咯烷酮是一類重要的化合物。衣康酸及其酯類是生產腈綸等化纖、合成樹脂、 塑料、橡膠、藥物、表面活性劑、無毒食品包裝材料、除草劑、除垢劑、粘著劑等工業原料，廣 泛用于化工行業。
[0003]衣康酸的生產方法有化學合成法、檸檬酸分解法和微生物發酵法。其中微生物 發酵法由于原料來源廣泛、成本低、生產條件溫和，是目前國內外生產衣康酸的主要方法。 在衣康酸的生產過程中，如何快速高效地獲得高產菌株至關重要。目前，衣康酸生產菌 種主要有屬于土曲霉群的土曲霉（Asp.terreus)和屬于灰綠曲霉群的衣康酸曲霉（Asp. itaconicus)。實際生產中應用最多的是土曲霉，但是Asp.terreus野生菌株一般產量都很 低，因此運用誘變育種的方法來獲得高產菌株的研究日益增加。而誘變后菌種篩選工作量 巨大而效率非常低，是目前制約工業微生物生產發酵的重要因素。高通量篩選技術，由于具 備微量、高效、靈敏、準確、可重復等特點，成為微生物篩選的主要技術手段。目前還未見適 合篩選衣康酸高產突變株的高通量篩選方法的相關報道。
[0004]本研究旨在建立一種高效快速篩選衣康酸高產菌株的高通量篩選方法。通過誘變 育種，結合高通量方法篩選衣康酸高產菌株，既可以提高工作效率，降低成本，又能大幅度 提高篩選速率。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種基于深孔板的衣康酸高產菌株的高通量篩選方法及菌 株。
[0006]本發明的技術方案為：一種衣康酸高產菌株，為土曲霉（Aspergillusterreus)， 保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 11039,保藏日期為2015年7月2日。
[0007] -種權利要求1所述的衣康酸高產菌株的基于深孔板的高通量篩選方法，包括菌 株的原生質體誘變；選擇性平板初篩；基于深孔細胞培養板的高通量篩選；搖瓶復篩及遺 傳穩定性考察，具體步驟為：第一步，菌株的原生質誘變：菌株培養后過濾滲透壓穩定劑沖 洗得到的菌絲體，收集菌絲體移入無菌三角瓶內加入酶液酶解，過濾去除菌絲片段，離心收 集原生質體，滲透壓穩定劑清洗后重懸于滲透壓穩定劑中；然后對得到的原生質體進行誘 變得到原生質體液；所述的原生質體誘變采用方法為紫外線誘變、DES誘變或者超聲波誘 變中的任一種；
[0008] 第二步，選擇性平板初篩：利用滲透壓穩定劑配制再生培養基，上層平板液事先放 入40~45°C水浴中保溫，將原生質體液加入上層平板液混勻，快速傾倒在已凝固的下層再 生平板上，倒置，培養箱溫度35~37°C，培養3~5d;平板的篩選因素為：溴甲酚綠、高糖、 代謝產物衣康酸或代謝前體琥珀酸中任意一種；
[0009] 第三步，基于深孔細胞培養板的高通量篩選：挑取再生平板單菌落挑至裝有 1. 2~2.OmL發酵培養基的深孔板中，在150~250r/min下，振蕩培養2~4d，離心，取上 清液測衣康酸含量，同時一一對應地接至裝有固體斜面培養基的深孔板中，于25~28°C恒 溫培養3~5d，用板封口膜密封，4°C冰箱保存；根據測定結果挑選菌株進行搖瓶復篩；
[0010] 第四步，搖瓶復篩及遺傳穩定性考察：將挑選出要進行搖瓶復篩的菌株從斜面培 養基中對應的菌落接種至含種子培養基的搖瓶中，搖床培養得到種液，進行搖瓶復篩；搖瓶 復篩的條件為 ：接種量5%~10%，35~37°(：，150~25(^/111111搖床培養3~5(1;連續傳代 培養5代，考察遺傳穩定性，篩選得到最穩定的菌株。
[0011] 第一步中所述的酶液為：纖維素酶4~8mg/ml，蝸牛酶2~4mg/ml，溶菌酶0. 5~ I. 5mg/ml的混合酶。
[0012] 所述的滲透壓穩定劑為0? 4~0? 65mol/L的NaCl水溶液。
[0013] 第三步所述的發酵培養基配方為：葡萄糖60~100g/L，（NH4)2SO4 1~5g/L， MgSO4. 7H201 ~3g/L，KH2PO4 1 ~3g/L，FeSO4 ? 7H20 0? 02 ~0? 05g/L，ZnSO4 ? 7H20 0? 01 ~ 0.lg/L，玉米漿I~3g/L，調節pH3. 0-3. 5 ;固體斜面培養基配方為PDA培養基。
[0014] 所述的紫外線誘變法為：吸取單孢子懸浮液5~8mL，加入到放于磁力攪拌器上的 直徑9cm的培養皿中，在15~20cm的距離下用15~20W的紫外燈照射50~200s。邊攪 拌邊照射，使孢子均勻的吸收紫外線光波。
[0015] 所述的DES誘變法為：用0? 1~0? 2mol/L的磷酸緩沖液，pH值5~8,分別配置體 積分數為〇. 5~2. 5%的DES溶液，各取以上DES溶液和菌懸液等量加入到無菌試管內混 勻，室溫振蕩處理5~lOmin，誘變處理結束后加入0. 5~lmL、1~2 %wt的NaS2O3終止反 應。
[0016] 所述的超聲波誘變法為：用移液槍移取2~4mL菌懸液，置于滅好菌的無菌離心管 中，運用超聲波細胞粉粹機，采用150~200W的功率，分別作用5~60min。
[0017] 第二步中平板篩選因素中，所述的高糖再生培養基配方為：葡萄糖160~250g/L， (NH4)2SO4 1 ~5g/L，MgS04. 7H20 1 ~3g/L，KH2P04 1 ~3g/L，FeS04，7H20 0? 02 ~0? 05g/L， ZnSO4 ? 7H20 0. 01~0.lg/L，玉米漿1~3g/L;溴甲酚綠再生培養基配方為：葡萄糖40~ 60g/L，（NH4)2SO4 1 ~5g/L，MgSO4. 7H20 1 ~3g/L，KH2PO4 1 ~3g/L，FeSO4 ? 7H20 0? 02 ~ 0.058/1，2沾04.71120 0.01 ~0.18/1，玉米漿1~38/1，0.2%的溴甲酚綠溶液 30-501111/ L;代謝產物衣康酸再生培養基配方為：葡萄糖40~60g/L，（NH4)2SO41~5g/L，MgS04. 7H20 1~3g/L，KH2PO4 1~3g/L，FeSO4 ? 7H20 0? 02~0? 05g/L，ZnSO4 ? 7H20 0? 01~0?lg/L，玉 米衆I~3g/L，衣康酸10~50g/L;代謝前體琥泊酸再生培養基配方為：葡萄糖40~60g/ L，（NH4)2SO4 1 ~5g/L，MgS04. 7H20 1 ~3g/L，KH2P04 1 ~3g/L，FeS04.7H20 0? 02 ~0? 05g/ L，ZnSO4 ? 7H200.Ol~0?lg/L，玉米漿 1 ~3g/L，琥珀酸 10 ~50g/L。
[0018] 第三步中所選深孔板為24孔或48孔深孔板；發酵培養基裝液量為I. 3~4mL，固 體斜面培養基裝液量為1. 8~4. 5mL。
[0019] 有益效果：
[0020] 本發明根據衣康酸產生菌的自身代謝特性，設計篩選平板，利用深孔板初篩，搖瓶 復篩的模式，大大提高了篩選工作效率。
【具體實施方式】
[0021] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0022] 以下實施例中，衣康酸的含量均采用高效液相色譜法（HPLC)測定。色譜條件如 下：色譜儀：AgillentllOO高效液相色譜儀；色譜柱：Bi〇-RadAminexHPX-87H;流動相： 0. 005mol/L硫酸，流速：0. 6mL/min;柱溫：55°C;檢驗器：示差折光檢驗器；進樣量：10yL。 外標法測定。
[0023] 本發明衣康酸高產菌株的高通量篩選方法，具體步驟是：
[0024] 原生質體制備
[0025] 將培養8-12h(35-37°C，150-250r/min)的土曲霉種液，用四層無菌擦鏡紙過濾 菌絲體，用滲透壓穩定劑沖洗幾遍，吸水紙吸干水分，收集菌絲體移入無菌三角瓶中。按 8-10mL/g濕菌絲體加入酶液（纖維素酶0. 4~0. 8%，蝸牛酶0. 2~0. 4%，溶菌酶0. 05~ 0. 15z% (w/v)的混合酶），緩慢震搖以分散菌絲體球，在33-35°C酶解2-4h。經4~6層無 菌顯微鏡擦鏡紙過濾，去除菌絲片斷，300~700g離心8~lOmin，收集原生質體，用滲透壓 穩定劑洗2~3次，重懸于滲透壓穩定劑中。
[0026] 原生質體誘變
[0027] 原生質體誘變所用方法為紫外線誘變、DES誘變或者超聲波誘變，誘變后采用雙層 平板法進行原生質體再生。
[0028] 如紫外線誘變方法為：吸取單孢子懸浮液5~8mL，加入到放于磁力攪拌器上的直 徑9cm的培養皿中，在15~20cm的距離下用15~20W的紫外燈照射50~200s。邊攪拌 邊照射，使孢子均勻的吸收紫外線光波。
[0029] 如DES誘變方法為：用0. 1~0. 2mol/L的磷酸緩沖液（pH值5~8)分別配置體 積分數為〇. 5~2. 5%的DES溶液。各取以上DES溶液和菌懸液等量加入到無菌試管內混 勻，室溫振蕩處理5~lOmin，誘變處理結束后加入0.5~lmL、1~2 %的NaS2O3終止反應。
[0030] 如超聲波誘變為：用移液槍移取2~4mL菌懸液，置于滅好菌的無菌離心管中，運 用超聲波細胞粉粹機，采用150~200W的功率，分別作用5~60min。
[0031] 原生質體選擇性平板初篩
[0032] 利用0. 4~0. 65mol/LNaCl作為滲透壓穩定劑配制再生培養基，上層平板液事先 放入40~45°C水浴中保溫，將原生質體液加入上層平板液混勻，快速傾倒在已凝固的下層 再生平板上。平板的篩選因素為：溴甲酚綠，或高糖，或代謝產物衣康酸，或代謝前體琥珀 酸。
[0033] 如高糖再生培養基配方為：葡萄糖160~250g/L，（NH4)2SO4 1~5g/L，MgSO4. 7H20 1 ~3g/L，KH2PO4 1 ~3g/L，FeSO4 ? 7H20 0? 02 ~0? 05g/L，ZnSO4 ? 7H20 0?Ol~0?lg/L，玉 米衆1~3g/L。
[0034] 如溴甲酸綠再生培養基配方為：葡萄糖40~60g/L，（NH4) 2S04 1~5g/L， MgSO4. 7H201 ~3g/L，KH2PO4 1 ~3g/L，FeSO4 ? 7H20 0? 02 ~0? 05g/L，ZnSO4 ? 7H20 0? 01 ~ 0?lg/L，玉米漿I~3g/L，0. 2%的溴甲酚綠溶液30-50ml/L。
[0035] 如代謝產物衣康酸再生培養基配方為：葡萄糖40~60g/L，（NH4)2SO4 1~5g/L， MgSO4. 7H20 1 ~3g/L，KH2P04 1 ~3g/L，FeS04.7H20 0? 02 ~0? 05g/L，ZnSO4.7H20 0? 01 ~ 0?lg/L，玉米衆I~3g/L，衣康酸10~50g/L。
[003