一種從冬棗中分離、純化多糖的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及多糖提取技術領域，尤其涉及一種從冬棗中分離、純化多糖的方法。
【背景技術】
[0002] 冬率（Zizyphusjujubecv.Dongzao)為鼠李科率屬植物，是率樹 (Zizyphusjujubecv)的果實，為我國特有的一種晚熟鮮食率。主要產于山東、河北等地，目 前在魯北地區種植面積已超過數百萬畝，故又稱魯北冬棗。冬棗因其果形美觀，色澤鮮艷， 果肉脆嫩多汁，富含19種人體所需的氨基酸和多種維生素，還含有豐富的鈣、鉀、鐵、鋅、銅 等多種礦物質微量元素和較多的藥用物質，如多糖、黃酮類、環磷酸腺苷等，有很高的食療 價值和多種保健功效，備受人們喜愛。冬棗糖分含量很高，且隨著成熟度的增加，多糖含量 也增加，在半紅期達到最高值(參見文獻：王百千，2012)。而多糖作為植物組織中的一類重 要活性物質，近年來由于植物多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗氧化等多種生 物活性、毒副作用小和不易造成殘留等優點，對植物多糖的研究日趨增加。因此提取多糖并 分離純化制備高純度的多糖對于開發生物活性產品具有十分重要的意義。
[0003] 糖類化合物廣泛分布在自然界中，其可分為單糖、低聚糖和多聚糖三類以及它們 的衍生物樹膠和黏液質等。其中多糖是一類天然高分子化合物，不僅是生物體重要的營養 物質，而且在生物體的生命活動中發揮重要的功能，與脂質、蛋白質、核酸一起被視為生物 體中最重要的4種生物大分子物質。
[0004] 多糖又稱多聚糖，是由醛糖或酮糖通過脫水形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分枝 連接而成的鏈狀聚合物。一般聚合度大于10,分子量為數萬至數百萬。目前國內外有關冬 棗的研究報道，主要集中在棗樹的栽培管理、果實的貯藏與加工、病蟲害防治等方面，冬棗 多糖提取分離純化工藝研究報道較少，目前有資料報道冬棗多糖的提取工藝，主要為熱水 浸提、超聲提取、微波提取以及微波輔助酶提，但提取出來的多糖含有大量的蛋白質、色素 以及其他一些小分子雜質，產品純度低、能耗高。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是，提供一種冬棗多糖的分離純化方法，以冬棗為原 料，采用水提、醇沉法得到一次粗多糖，并對提取的一次粗多糖進行了脫蛋白和脫色處理， 膜過濾后的二次粗多糖，再依次利用離子交換一次層析、凝膠色譜柱二次層析方法首次制 備出兩種冬棗多糖純品DPl和DP2,并對其理化性質、分子量、單糖組成等進行了鑒定，且制 得的冬棗多糖DP1、多糖DP2具有一定的抗氧化活性，產品純度高、能耗低，高品質的多糖為 將來在食品、保健品、化妝品等領域更好的開發利用奠定了基礎。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案： 一種從冬棗中分離、純化多糖的方法，包括以下步驟：（1)采用水提、醇沉法從冬棗中 提取出一次粗多糖；（2)將所述一次粗多糖采用酶-三氯乙酸法進行脫蛋白處理，離心分離 得到一次上清液；（3)將所述一次上清液加入活性炭進行脫色處理，得到二次上清液；（4) 所述二次上清液經膜過濾得二次粗多糖；（5)將所述二次粗多糖上離子交換柱一次層析， 得多糖DPl粗品和多糖DP2粗品；（6)將一次層析后的多糖DPl粗品和多糖DP2粗品分別 上凝膠色譜柱進行二次層析，得到多糖DPl純品和多糖DP2純品。
[0007] (1)粗多糖的提取：挑選大小均勻、無腐爛和無機械傷的冬棗，洗凈去核切成片狀 在60°C烘干后粉碎過60目篩，制得冬棗干粉末，按照冬棗粉與水的質量比為1:20~1:30， 室溫條件下浸泡30分鐘后，經熱水浸提，得到粗多糖提取液和濾渣；將粗多糖提取液進行 濃縮，濃縮至原體積的1/2~1/4得濃縮液，向該濃縮液中加入質量濃度90%~100%的乙 醇進行醇沉，乙醇與濃縮液的體積比為2~4倍，醇沉4~8h，醇沉后進行離心，得冬棗粗多 糖沉淀物，將所述冬棗粗多糖沉淀物在60°C條件下真空干燥即得一次粗多糖。
[0008] (2)脫蛋白：將步驟（1)中制得的所述粗多糖配成濃度為1% (g/mL)的粗多糖溶 液，向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，其中，脫蛋白的酶解溫度為40-60°C，加 酶量為150-450U/mL，酶解時間為l-2h;酶解后在沸水浴中滅酶15分鐘后自然冷卻，冷卻后 加入三氯乙酸(質量分數20%)得質量濃度為5%-9%的一次混合溶液，將所述混合溶液置于 4°C冰箱中靜置過夜，在轉速為5000rpm/min條件下離心10分鐘，收集一次上清液備用。
[0009] (3)脫色：將步驟（2)中所述一次上清液用1%的氫氧化鈉溶液調節PH值至7. 0后， 加入活性炭，活性炭與上清液的量為1:100 (g/mL)得二次混合溶液，在溫度為40°C條件下 脫色40min，將脫色后的所述二次混合溶液在轉速為5000rpm/min條件下離心10分鐘，收集 二次上清液備用。
[0010] (4)過濾：將步驟（3)中的所述二次上清液用0.45iim微孔濾膜過濾，過濾后減壓 濃縮，在60°C條件下真空干燥，得二次粗多糖。
[0011] (5)離子交換法一次層析：采用DEAE-52纖維素柱進行一次層析，將步驟（4)中的 二次粗多糖上樣，依次用蒸餾水、〇? 2mol/L的NaCl、0. 3mol/L的NaCl和0? 5mol/L的NaCl 進行分段洗脫，再經減壓濃縮、在流水、蒸餾水中分別透析48h、24h后分別得多糖DPl粗品 和多糖DP2粗品。
[0012] (6)二次層析：采用S印hadexG-100凝膠色譜柱進行二次層析，分別將步驟（5)中 的多糖DPl粗品和DP2粗品上樣，均用蒸餾水洗脫，減壓濃縮、60°C真空干燥后制得多糖DPl 純品和多糖DP2純品。
[0013] (7)理化性質測定：步驟（6)中所述多糖DPl純品和所述多糖DP2純品的濃度和分 子量均測定采用凝膠色譜法測定，所述多糖DPl純品和所述多糖DP2純品的組成、比旋度、 糖醛酸含量分別采用糖腈乙酰酯化衍生-氣相色譜法、旋光光度法和硫酸_咔唑法測定。
[0014] 所述多糖DPl組成主要為阿拉伯糖和葡萄糖，測定可知，阿拉伯糖、甘露糖、 葡萄糖和半乳糖的摩爾比為6. 6:1:6. 8:2. 1，所述多糖DP2組成主要為阿拉伯糖、半 乳糖和葡萄糖，測定可知，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比為 1. 4:11. 0:1:3. 2:4. 8 ;另外，對多糖DPl和多糖DP2的抗氧化活性進行測定，實驗證明DPl 和DP2具有一定的清除羥自由基清除率，對DPPH的清除率多糖DP2明顯高于多糖DPI。
[0015] 本發明的有益效果是， (1)采用酶-三氯乙酸法結合的方法進行脫蛋白處理，操作簡便，無須重復多次，蛋白 質脫除率高、多糖損失少。
[0016] (2)采用活性炭脫色的方法，相比于其它脫色方法，如樹脂、過氧化氫脫色，成本 低，脫色率和多糖保留率高。
[0017] (3)用離子交換樹脂進行分離時采用分段洗脫就可以完成，方便收集洗脫液。
[0018] (4)本發明對制備出的兩種多糖組成以及純度進行了鑒定，明確了各多糖組分的 理化性質，通過研究表明冬棗多糖DP1、多糖DP2具有一定的抗氧化活性，為更好的進行冬 棗多糖開發奠定了基礎。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明中的DEAE-52纖維素柱一次層析后的洗脫曲線圖。
[0020] 圖2為本發明中的多糖DPl粗品經過SephadexG-IOO柱后的洗脫曲線圖。
[0021] 圖3為本發明中的多糖DP2粗品經過SephadexG-IOO柱后的洗脫曲線圖。
[0022] 圖4為多糖DP