一種單環刺螠內臟糖胺聚糖的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及從單環刺縊內臟中提取糖胺聚糖的方法及該糖胺聚糖的應用，屬于對單環刺縊綜合加工利用的技術方法。
【背景技術】
[0002]單環刺￠1 益(Urechis unicinctus)俗名海腸、海腸子，屬于蟲益蟲動物門Echiur1idea ￠1 益綱 Echiurida、無管!?!益目 Xenopneusta、刺!?!益科 Urchidae,體粗大，長約100-300mm，寬約25_27mm，體表滿布大小不等的粒狀突起，吻圓錐形，腹剛毛I對，粗大，肛門周圍有一圈9-13條褐色尾剛毛，分布于俄羅斯、日本、朝鮮和我國黃渤海沿岸，是我國北方沿海泥沙岸潮間帶下區及潮下帶淺水區底棲生物的常見種。單環刺縊個體肥大，肉味鮮美，體壁肌富含蛋白質和多種人體必需氨基酸，自古以來，在我國、日本和朝鮮沿海均作為名貴的海鮮食品，有較高的經濟價值。
[0003]目前單環刺縊已實現人工養殖，由于人們的傳統做法只食用其體壁，因此在生產加工環節中單環刺縊的內臟作為廢棄物被丟棄，造成了資源的很大浪費，也對環境造成了嚴重的污染。事實上，內臟占單環刺縊身體質量的2/3，研究發現單環刺縊內臟中蛋白質含量為18.25%，脂肪含量為0.12%，總糖含量為4.09%，含有豐富的Ca、Mg、Fe、Zn等元素，同時也含有豐富的EPA、DHA和DPA等。
[0004]隨著對海洋生物資源的開發和糖類藥物研究的日益重視，海洋動物活性多糖的研究也越來越受到廣泛的關注，如海參糖胺聚糖具有提高免疫、抗腫瘤、抗凝血等多種活性，是海參中主要的活性物質，海參糖胺聚糖的提取方法也有較多研究，如申請號為201010112839.6 (申請公布號CN101787084A)的中國發明專利《一種刺參糖胺聚糖的制備方法》、專利號為ZL200910305363.5(授權公告號CN101624426B)的中國發明專利《一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法》等。海參內臟中也含有豐富的多糖活性物質，對海參廢棄內臟多糖的研究不僅避免了資源的浪費，還提高了海參加工的附加產值。而單環刺縊不光長得像裸體海參，其營養價值比起海參也不遜色，以海參內臟多糖研究為指導，對單環刺縊內臟多糖進行深入研究，以期篩選出活性多糖成分，為單環刺縊內臟的廢物再利用，提高單環刺蟲益的經濟產值提供重要參考。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術而提供一種利用單環刺縊內臟提取單環刺縊內臟糖胺聚糖的制備方法。
[0006]本發明所要解決的另一個技術問題提供一種上述單環刺縊內臟糖胺聚糖的應用。
[0007]本發明解決第一個技術問題所采用的技術方案為:1、一種單環刺縊內臟糖胺聚糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0008](I)預處理:取新鮮單環刺縊內臟，絞碎勻漿，加入3?4倍體積丙酮，磁力攪拌過夜后，抽濾取沉淀，將沉淀烘干后粉碎得單環刺縊內臟干粉；
[0009](2)酶解:按料液比(g/ml) 1:18?20，在內臟干粉中加入蒸餾水，75?80°C水浴提取4?5h后，調節pH值為6?7，加入內臟干粉重量I?1.2 %的木瓜蛋白酶，55?65°C水浴消化4?5h，調節pH值為8.2?9.0，加入內臟干粉重量0.5?0.6 %的胰蛋白酶，55?65°C水浴消化3?4h，調節pH值為7.0,100°C下滅活5?15分鐘；
[0010](3)提取:6000rpm離心8min取上清液，濃縮至原體積的1/15后，加入乙醇至醇含量為80%,靜置過夜，6000rpm離心8min取沉淀,得內臟糖胺聚糖粗品；
[0011](4)純化:按料液比(mg/ml)l:100，將內臟糖胺聚糖粗品溶解于蒸餾水后透析，冷凍干燥得內臟糖胺聚糖。
[0012]作為優選,所述透析法截留的分子量為3.5?4.1kDa0
[0013]一種如權利要求1所述的單環刺縊內臟糖胺聚糖在預防和調節血脂的食品、保健品及藥品中的應用。
[0014]作為優選，所述單環刺縊內臟糖胺聚糖的單糖組成包括葡萄糖、氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸以及氨基半乳糖，以摩爾比計，葡萄糖:氨基葡萄糖:甘露糖:半乳糖:巖藻糖:木糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:氨基半乳糖的比例為5.37:
1.38:1:1.38:2.4:1.05:0.87:0.52:1.38，重均分子量為 3.5 ?4.1kDa0
[0015]為使所述單環刺縊內臟糖胺聚糖獲得較好的抗脂質過氧化活性，所述單環刺縊內臟糖胺聚糖清除自由基的有效濃度為2.47?10mg/ml。
[0016]與現有技術相比，本發明的優點在于:利用單環刺縊廢棄內臟為原料，通過兩步酶解法提取獲得重均分子量在3.5?4.1kDa之間的糖胺聚糖，該提取方法簡單，得率可達6% _7%，采用木瓜蛋白酶與胰蛋白酶相結合水解，大大降低了內臟多糖的蛋白含量，從而提高了糖胺聚糖的純度。同時，該單環刺縊內臟糖胺聚糖在體外抗脂質過氧化模型中具有良好的抗脂質過氧化活性，10mg/ml時對自由基的清除率接近90%，因此該內臟糖胺聚糖可進一步加工成預防和調節血脂的食品、保健品及藥品，從而為預防和調節血脂開辟新的途徑。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明中單環刺縊內臟糖胺聚糖的PMP柱前衍生高效液相色譜圖；
[0018]圖2為10種單糖標準品的PMP柱前衍生高效液相色譜圖；
[0019]圖3為本發明中單環刺縊內臟糖胺聚糖的高效凝膠滲透色譜圖；
[0020]圖4為本發明中單環刺縊內臟糖胺聚糖的脂質過氧化消除曲線。
【具體實施方式】
[0021]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0022]實施例1:單環刺縊內臟糖胺聚糖制備一
[0023]取新鮮的單環刺縊，用剪刀從其肛門插入，沿腹部剖開，或沿著背部剖開，取出所有內臟，將取出的內臟清洗干凈后用絞肉機粉碎勻漿，加入4倍體積的丙酮脫脂，磁力攪拌(200rpm)過夜后，抽濾取沉淀，將沉淀烘干后粉碎得單環刺縊內臟干粉。在制得的內臟干粉中，按料液比(g/ml) 1:20加入蒸餾水，80°C水浴提取4h后，調節pH值為7，加入內臟干粉重量1%的木瓜蛋白酶，60°C水浴消化4h，調節pH值為9.0 ;加入內臟干粉重量0.5%的胰蛋白酶，60°C水浴消化3h，調節pH值為7.0,100°C下滅活5分鐘，以使未反應的酶失活。將制得的酶解液6000rpm離心8min取上清液，將上清液濃縮至原體積的1/15，加入乙醇至醇含量為80%，靜置過夜，6000rpm離心Smin取沉淀，得內臟糖胺聚糖粗品。按料液比(mg/ml) 1:100,將內臟糖胺聚糖粗品溶解于蒸餾水后過3500透析袋透析，冷凍干燥得棕色絮狀的內臟糖胺聚糖，本實施例中內臟糖胺聚糖的得率為6.5%。
[0024]實施例2:單環刺縊內臟糖胺聚糖制備二
[0025]取新鮮的單環刺縊，用剪刀從其肛門插入，沿腹部剖開，或沿著背部剖開，取出所有內臟，將取出的內臟清洗干凈后用絞肉機粉碎勻漿，加入3倍體積的丙酮脫脂，磁力攪拌(200rpm)過夜后，抽濾取沉淀，將沉淀烘干后粉碎得單環刺縊內臟干粉。在制得的內臟干粉中，按料液比(g/ml) 1:18加入蒸餾水，75°C水浴提取5h后，調節pH值為6，加入內臟干粉重量1.4%的木瓜蛋白酶，65°C水浴消化4h，調節pH值為8.5，加入內臟干粉重量0.6%的胰蛋白酶，65°C水浴消化4h，調節pH值為7.0,100°C下滅活15分鐘，以使未反應的酶失活。將制得的酶解液6000rpm離心8min取上清液，將上清液濃縮至原體積的1/15，加入乙醇至醇含量為80%，靜置過夜，6000rpm離心8min取沉淀，得內臟糖胺聚糖粗品。按料液比(mg/ml) 1:100，將內臟糖胺聚糖粗品溶解于蒸餾水后過3500透析袋透析，冷凍干燥得棕色絮狀的內臟糖胺聚糖，本實施例中內臟糖胺聚糖的得率為7%。
[0026]實施例3:單環刺縊內臟糖胺聚糖制備三
[0027]取新鮮的單環刺縊，用剪刀從其肛門插入，沿腹部剖開，或沿著背部剖開，取出所有內臟，將取出的內臟清洗干凈后用絞肉機粉碎勻漿，加入4倍體積的丙酮脫脂，磁力攪拌(200rpm)過夜后，抽濾取沉淀，將沉淀烘干后粉碎得單環刺縊內臟干粉。在制得的內臟干粉中，按料液比(g/ml) 1:18加入蒸餾水，80°C水浴提取4h后，調節pH值為6，加入內臟干粉重量1.2%的木瓜蛋白酶，55°C水浴消化5h，調節pH值為8.2，加入內臟干粉重量0.6%的胰蛋白酶，55°C水浴消化4h，調節pH值為7.0,100°C下滅活15分鐘，以使未反應的酶失活。將制得的酶解液6000rpm離心8min取上清液，將上清液濃縮至原體積的1/15，加入乙醇至醇含量為80%，靜置過夜，6000rpm離心8min取沉淀，得內臟糖胺聚糖粗品。按料液比(mg/ml) 1:100，將內臟糖胺聚糖粗品溶解于蒸餾水后過3500透析袋透析，冷凍干燥得棕色絮狀的內臟糖胺聚糖，本實施例中內臟糖胺聚糖的得率為6%。
[0028]實施例2:單環刺縊內臟糖胺聚糖組成確認
[0029]2.1單糖組成
[0030]采用PMP柱前衍生高效液相色譜法測定由實施例1或實施例2或實施例3獲得的單環刺縊內臟多糖的單糖組成。
[0031]2.1.1樣品的全水解
[0032]取適量樣品，用2mol.L 1TFA在110°C進行全水解6h，反復加甲醇旋轉蒸發除去TFA至無酸味，用適量蒸餾水洗出。
[0033]2.1.2衍生條件
[0034]取100 μ L上述標準品溶液置1.5mL的EP管中，加入100 μ L0.3mol *L 1NaOH溶液，120 μ L0.5mol.L 1PMP 溶液，70°C衍生 lh，反應完加入 100 μ L0.3mol.L 1HCl 溶液中和，力口500 μ L氯仿反復萃取離心，上清用0.22 μ m微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜分析。
[0035]2.1.3色譜條件
[0036]色譜柱:Agilent XDB-C18色譜柱(4.6mmX 150mm, 5 μ m);流動相:磷酸鹽緩沖液(pH6.7)/CH3CN(82:18，V/V);流速:1.0mL.min 1 ;柱溫:30°C ;進樣量:20μ L ;檢測器:DAD(245nm)。
[0037]2.1.4樣品單糖組成測定
[0038]全水解完的樣品與標準品在相同條件下衍生，進樣20 μ L，高效液相色譜分析，記錄色譜圖。與各單糖標準品的出峰時間對照，確定樣品單糖組成，結果如圖1所示。由圖1、圖2對比可知，內臟糖胺聚糖的單糖組成非常復雜，既含有中性糖、又含有酸性糖和堿性糖的雜多糖，而中性糖中還包括的六碳糖、五碳糖和六碳甲基糖。單糖組成中葡萄糖(Glc)是最主要成分，其次還含有氨基葡萄糖(GlcN)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和巖藻糖(Fuc),還含有少量的木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcUA)和氨基半乳糖(GalN)。比例分別為 Man:GlcN:Rha:GlcUA:GalN:Glc:Gal:Xyl:Fuc = 1:1.38:0.87:0.53:0.52:5.37:1.38