鄰苯二甲酸二乙酯人工免疫原及其制備和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鄰苯二甲酸二乙酯人工免疫原DEP-BSA及其制備和用途，具體涉 及的是一種用于新興持久性有機污染物一一鄰苯二甲酸二乙酯免疫檢測的鄰苯二甲酸二 乙酯人工免疫原DEP-BSA及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 鄰苯二甲酸酯類塑化劑（縮寫為PAEs)，又稱酞酸酯類，是一類由鄰苯二甲酸與含 有4-15個碳的醇發生費歇爾（Fischer)酯化反應所形成的酯的重要衍生物的統稱。這類物 質有特殊性氣味，毒性較大，一般情況下狀態為粘稠液體；液態條件下溫度范圍寬，流動性 大，揮發性低，不溶于水，易溶于大多數有機溶劑。這類物質用途廣泛，它不僅可作為食品包 裝材料、玩具、農藥載體、驅蟲劑、潤滑劑、乙烯地板和壁紙、去泡劑、清潔劑、醫用材料（如 人工心臟瓣膜等人工器官、血袋、注射器和膠管）和個人護理用品（主要有化妝品、香味品、 指甲油、頭發噴霧劑、香皂和洗發液）等近千種產品的生產原材料，還常作為塑料增塑劑被 用于改造塑料制品性能。
[0003] 其中，鄰苯二甲酸二乙酯（英文名稱：Diethylphthalate，簡稱DEP)，又名酞酸二 乙酯，CAS號為84-66-2,分子式為C12H14O4，分子量為222. 24,無色至微黃色澄清油狀液體， 極易溶解于乙醇，幾乎不溶于水；遇明火、高熱可燃燒，具有刺激性。該物質低毒，對皮膚、 眼睛、上呼吸道有刺激作用；經皮膚吸收或攝入后可引起頭痛、頭暈和嘔吐；具潛在的光毒 性、輕度致敏；對女性子宮有影響，可能導致胎兒畸形或死亡 ]。由于它能與大多數樹脂的相 容性比較好，因此，它主要作為樹脂的增塑劑而廣泛應用；此外，還可作為潤滑劑、起泡劑、 香水及藥用包衣材料的輔料。近些年來，有研究學者發現該物質在食品（如：酒、飲料等） 中的含量過高從而危及食品安全，因此便備受人們關注。
[0004]目前，關于鄰苯二甲酸二乙酯的研究主要集中在水體、沉積物、大氣等環境領域和 生物體的毒性方面，但樣品的檢測方法方面研究較少。目前對鄰苯二甲酸二乙酯的檢測手 段主要為氣相色譜和高效液相色譜等儀器檢測方法，這些方法雖然準確可靠，但對樣品的 預處理方法和操作人員的專業性有很高的要求。正因為這些方法的處理復雜、耗時、儀器價 格昂貴而不適合推廣使用，也不利于在環境污染事故現場快速檢測。為克服這些缺點，尋求 一種快速、簡便、靈敏且經濟實用的分析方法就成為環境監測領域的主要研究方向。
[0005] 20世紀60年代發展起來的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗體的特 異性、可逆性結合反應的分析技術。免疫分析具有常規理化分析技術無可比擬的選擇性和 高靈敏性，非常適合復雜介質中痕量組分的分析。因此免疫分析具有的特異性強、靈敏度 高、方法快捷簡單、分析通量大、檢測成本低等優點，使得該類方法可以滿足簡單、快速、靈 敏地檢測持久性有機污染物的要求。1971年Engvail,VanWeerman等報道了檢測體液中 微量物質的固相免疫分析技術，即酶聯免疫吸附分析法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)。目前，ELISA方法已經成為免疫分析方法中重要的組成部分。ELISA方法是 將抗原-抗體之間的免疫反應與酶的高效催化特性有機結合而發展起來的一種免疫分析 方法。其中，以親和素-生物素信號放大系統為基礎的親和素-生物素化酶聯免疫吸附分 析法，以生物素標記抗體（抗原），并以酶標親和素代替ELISA方法中酶標抗體。親和素是 卵白蛋白中的一種堿性糖蛋白，分子量約為68kDa。一個親和素分子由4個亞單位組成，每 個亞單位都可以與一個生物素分子（分子量為244)特異性結合。生物素與親和素結合特 異性強，其親和力比抗原抗體反應大得多，親和常數高達1015M1。由于一個親和素能與4個 生物素分子結合，因此在檢測中可提高被固相結合酶的數量，進而提高檢測方法的靈敏度。
[0006] 現有技術中，一篇名為"環境激素鄰苯二甲酸二甲酯（二乙酯）的熒光免疫分析新 方法研究"的碩士論文中公開了一種鄰苯二甲酸二乙酯的熒光免疫分析方法，但該方法中 免疫原制備方法粗糙，不易重復出來。
[0007]目前尚沒有親和素-生物素化酶聯免疫吸附分析法檢測鄰苯二甲酸二乙酯的相 關報道。而制備合格的DEP人工免疫原是生物免疫得到高特異性抗DEP抗體的前提，更是 建立DEP免疫檢測分析方法的關鍵，這將具有重要的應用價值和理論研究意義。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種步驟簡單，速度快，產率高的鄰 苯二甲酸二乙酯人工免疫原（DEP-BSA)制備方法，為免疫得到特異性抗體和利用人工抗 原、抗體建立免疫檢測方法奠定基礎。
[0009] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0010] 本發明提供了一種鄰苯二甲酸二乙酯的人工免疫原DEP-BSA，其特征在于，結構式 如式⑴所示：
[0012] 本發明還提供了一種鄰苯二甲酸二乙酯的人工免疫原DEP-BSA的制備方法，所述 方法包括以下步驟：
[0013] 采用重氮化法將DEP半抗原與蛋白質分子BSA偶聯制備人工免疫原DEP-BSA。
[0014] 優選地，所述DEP半抗原的制備方法包括如下步驟：
與乙醇發生酯化反應，生成4-硝基鄰苯二甲酸二乙酯；
[0016] A2、在非質子性有機溶劑存在的條件下，所述4-硝基鄰苯二甲酸二乙酯和鋅粉、 強酸b發生還原反應，生成鄰苯二甲酸二乙酯半抗原，S卩DEP半抗原。
[0017]DEP半抗原化學名稱為4-氨基鄰苯二甲酸二乙酯，分子式為C12H15NO4，分子量： 237. 25。
[0018] 優選地，所述步驟Al中，4-硝基鄰苯二甲酸、乙醇、強酸性介質a的摩爾比為 1: (5~7) : (0. 6~0. 8)，反應液a的溫度為86~90°C，酯化反應時間為8~10小時；所 述步驟A2中，4-硝基鄰苯二甲酸二乙酯、非質子性有機溶劑a、強酸b和鋅粉的摩爾比為 1: (550~580) : (20~22) : (18~20)，反應液b的溫度為25~35°C，還原反應時間為10~ 12小時；所述強酸性介質a和強酸b獨立地選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸中的一種，所述非 質子性有機溶劑選自苯或甲苯。
[0019] 理想狀態下，4-硝基鄰苯二甲酸、乙醇的摩爾比是1:2,但為了反應順利進行，一 般乙醇的用量是4-硝基鄰苯二甲酸的摩爾量的5倍以上，但不能超過4-硝基鄰苯二甲酸 的摩爾量的7倍；此外，強酸作為酯化反應的催化劑，所用量一般是原料4-硝基鄰苯二甲酸 摩爾量的0. 6倍以上，但不超過原料4-硝基鄰苯二甲酸摩爾量的0. 7倍；乙醇在86°C處于 沸騰狀態，那么90°C更處于沸騰狀態，反應向右進行。此外，理想狀態下4-硝基鄰苯二甲酸 二乙酯、強酸和純鋅粉的摩爾比是1:10:10,但為了反應順利向右進行，一般純鋅粉的用量 是原料4-硝基鄰苯二甲酸二乙酯摩爾量的18倍以上，但不能超過原料4-硝基鄰苯二甲酸 二乙酯、摩爾量的20倍；此外，強酸作為還原反應的強氧化劑，所用量一般是原料純鋅粉摩 爾數的1倍以上，但不超過原料純鋅粉摩爾數的I. 1倍，而非質子性有機溶劑苯的摩爾數需 要是強氧化劑摩爾數的25倍以上，但不超過強氧化劑摩爾數的28倍。
[0020] 優選地，所述步驟Al還包括酯化反應完全后，蒸餾除去未反應的乙醇和生成的 水，再趁熱將液體倒入冰水中，析出的油狀粗品用10%Na2OV^液洗滌至水層呈無色，干燥 DEP半抗原中間體的步驟。
[0021] 優選地，所述步驟A2還包括還原反應完全后，用冰水和強堿溶液以終止反應，萃 取反應液，分離，除雜質，干燥，重結晶，層析柱分離純化DEP半抗原的步驟。
[0022] 優選地，所述強堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀。
[0023] 優選地，所述鋅粉為純鋅粉，即化學級別分析純，國藥試劑公司生產。
[0024] 優選地，所述采用重氮化法將DEP半抗原與蛋白質分子BSA偶聯制備人工免疫原 DEP-BSA具體包括以下步驟：
[0025]B、將DEP半抗原溶于強酸c中，形成DEP半抗原溶液；向DEP半抗原溶液中加入亞 硝酸鈉溶液，反應，生成重氮鹽溶液；
[0026] C、將牛血清蛋白BSA溶于硼酸鈉緩沖液中，形成牛血清蛋白溶液；
[0027]D、向所述重氮鹽溶液中加入牛血清蛋白溶液形成反應液，攪拌反應。
[0028] 本發明采用重氮化法合成鄰苯二甲酸二乙酯人工免疫原，其反應方程式如下：
[0029]
[0030] 上述反應方程式中，中間產物重氮鹽與牛血清蛋白BSA結合，偶聯脫水，生成了
[0031] 優選地，步驟B中，所述DEP半抗原、強酸c、亞硝酸鈉、牛血清蛋白BSA的摩爾比為 1:3~4:8~10:0. 001~0. 01 ;所述強酸c為濃鹽酸、濃硫酸或濃硝酸中的一種。
[0032] 優選地，步驟B的反應過程還包括用pH試紙控制反應酸度為2. 0-3. 0,反應結束后 加尿素去除未反應的亞硝酸鈉；所述DEP半抗原與尿素的摩爾比為I:300~320。
[0033] 優選地，步驟D中，所述攪拌時間為2~4小時。
[0034] 為充分反應，根據經驗，當半抗原與強酸、亞硝酸鈉、BSA的摩爾比為1:3:8:0. 001， 半抗原與尿素的摩爾比為1:300時攪拌反應2小時就可以，當半抗原與與強酸、亞硝酸鈉、 BSA的摩爾比為1:4:10:0. 005,半抗原與尿素的摩爾比為1:320時反應就需要4小時。
[0035] 優選地，步驟B中，所述將DEP半抗原溶液加入亞硝酸鈉溶液是在0~4°C低溫磁 力攪拌下進行。一方面，為了后面加入蛋白質的時候不會使其變性或失活，所有需要保持蛋 白活性的長時間反應都需要在低溫情況下進行，經驗表明0~4°C最合適；另一方面，亞硝 酸鈉加入與4-氨基鄰苯二甲酸二乙酯反應生成重氮