抗卵巢癌單抗coc166-9的對應抗原及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗卵巢癌單抗C0C166-9的對應抗原及其應用，具體而言，本發明涉及 抗卵巢癌單抗C0C166-9的對應抗原（本發明中將其命名為CA166-9)的克隆鑒定及其在判 斷卵巢癌預后及卵巢癌治療中的應用。
【背景技術】
[0002] 卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，雖然其發病率僅次于子宮頸癌和子宮體 癌而列居第三位，但因卵巢癌致死者卻居首位，對婦女的生命造成了嚴重威脅。目前在全球 范圍內，卵巢癌的發病率仍在逐年增加。由于卵巢的胚胎發育，組織解剖及內分泌功能較復 雜，它所患的腫瘤可能是良性或者是惡性。由于卵巢癌臨床早期無癥狀，鑒別其組織類型及 良惡性在臨床也存在一定困難，臨床上診斷的卵巢癌大部分已經擴散到子宮雙側附件、大 網膜及盆腔各器官，其五年生存率僅25%~30%。目前傳統的預后指標（如腫瘤大小、臨 床分期（TNM)、病理分型、組織分級）不能完全正確判斷卵巢癌患者的預后情況，因而導致 對部分病人的治療不當，因此，需要尋找更可靠的指標單獨或結合其它指標，用于判斷患者 預后情況，以選擇個體化的治療方案。
[0003] C0C166-9是北京大學人民醫院婦科腫瘤中心在上世紀八十年代用上皮型卵巢 癌組織粗提液免疫小鼠后經細胞融合制備獲得的一株單克隆抗體，其與卵巢癌有較好的 組織反應特異性（錢和年，抗卵巢上皮癌相關抗原單克隆抗體C0C166-9的制備.北 京大學學報（醫學版），1987(4):?.35-37)。單抗0)(：166-9在卵巢癌的表達率在75% 以上，與正常和非腫瘤組織極少發生交叉（張春玲，卵巢癌單抗免疫組化診斷試劑盒 制備的研究.浙江腫瘤，1995.1(l):p.8-9)。其與同位素的交聯物能明顯延長荷瘤小 鼠的生存期（李小平，卵巢癌C0C166-9單克隆抗體片段的制備及其在放射免疫顯像 中的應用.中華婦產科雜志，1997. 32 (3) :p. 152-155)。用該抗體制備獲得的抗獨特 型抗體（Ab2)6Bll能成功誘導出淋巴細胞對卵巢細胞的有效殺傷作用（Chang，X.，et al. ,Preparationofhumanizedovariancarcinomaanti-idiotypicminibody. HybridHybridomics, 2003. 22(2) :p. 109-15 ;昌曉紅，卵巢癌 6B11 抗獨特型微抗體誘 導抗腫瘤免疫應答的體外實驗.北京大學學報（醫學版），2005. 37(5) :p. 480-484)，并 能誘導產生可與卵巢癌細胞特異結合的抗抗獨特型抗體（Ab3)(倪俊，卵巢癌單克隆 抗-抗獨特型抗體32F2的制備及其特性研究.中國婦產科臨床雜志，2007. 18 (6) :p. 448 ; 張超，卵巢癌抗抗獨特型單克隆抗體3D12的制備及初步研究.北京大學學報（醫學 版），2008. 40(2) :p. 170-173)。通過與上海生源醫藥研究有限公司的合作，目前已完 成對具抗原內影像的抗獨特型抗體6B11的微型化改造及臨床前相關研究的主要工作 (張果，卵巢癌抗獨特型單鏈抗體6BllScFv/鼠HSP70融合蛋白復性條件的研究.中 國醫藥生物技術，2009.4 (6):p. 424-429 ;Cui,H.，etal.，Theanti-tumorimmune responsesinducedbyafusionproteinofovariancarcinomaanti-idiotypic antibody6B1IScFvandmurineGM-CSFinBALB/cmice.IntJGynecol Cancer, 2004. 14(2):p. 234-41 ；Shi,J. ,etal.,Expressionofanovariancancer anti-idiotypeantibody(6B11VLVHCH3)inChinesehamsterovary(CHO)cellswith improvedimmunoactivityandstabilityoverproteinsexpressedinprokaryotic cells.Hybridoma(Larchmt), 2007. 26 (5) :p. 289-95)，并擬作為卵巢癌疫苗試用于臨床。 [0004]然而，雖然單抗C0C166-9對卵巢癌有良好的反應特異性和敏感性，無論是與同位 素的標記物或是與免疫毒素的偶聯物，還是源自C0C166-9的小分子抗獨特型疫苗，均展示 出良好的潛在臨床應用前景，但由于其對應抗原分子（CA166-9)迄今尚未獲得克隆和鑒 定，阻礙了它在臨床的應用，同時也嚴重影響了相關產品的進一步開發和對其相關分子機 制的研究。
【發明內容】
[0005] 本申請的一個目的在于鑒定抗卵巢癌單抗C0C166-9的對應抗原（本發明中將 "C0C166-9的對應抗原"命名為"CA166-9"），并提供其相關功能。
[0006] 本案發明人通過親和層析、質譜鑒定和多種免疫學方法的相互驗證，確定了單抗 C0C166-9的對應抗原（CA166-9)為人免疫球蛋白gamma-1重鏈恒定區樣（IGHGl)蛋白，并 通過卵巢癌細胞的表型實驗初步探討了CA166-9的生物學功能。
[0007] 本發明提供了單抗C0C166-9的對應抗原CA166-9。根據本發明的具體實施方案， 所述的CA166-9包括如下（a)、（b)或（c)所示的蛋白或其免疫性片段：
[0008] (a)由SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白或其免疫性片段；或
[0009] (b)與（a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與（a) 具有相同功能的由（a)衍生的蛋白或其免疫性片段；
[0010] (C)在（a)限定的氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選95%以上同 源性且具有相同功能的由（a)衍生的蛋白或其免疫性片段。
[0011] 本發明還提供了編碼CA166-9的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多 核苷酸序列優選包括SEQIDNo. 1第1-597位所示的多核苷酸序列。
[0012] 本發明中，綜合運用親和層析、MALDI-T0F-MS質譜分析、不同的免疫競爭抑制實 驗、抗原克隆和表達產物的鑒定分析等方法，對CA166-9進行了純化、分析、鑒定和多角度 的驗證。其中，通過免疫細胞化學（ICH)等實驗，確定了SK0V-3、Caov-3細胞為C0C166-9 對應抗原的陽性細胞系，而在后續的WesternBlot和免疫沉淀實驗中，在這些陽性細胞里 并沒有檢測到與單抗C0C166-9特異性反應條帶，提示C0C166-9對應抗原蛋白在細胞中 的表達豐度較低，尚不足以用一般的免疫沉淀和WesternBlot檢測到。本發明將大量的 Caov-3細胞（約2XIO9)總蛋白通過免疫親和層析柱純化后，成功捕獲了三條能夠與單抗 C0C166-9特異性結合的條帶，為Caov-3細胞總蛋白來源的C0C166-9對應抗原的成功純化 提供了保證。進一步地，對純化抗原蛋白經酶解之后，將酶解肽段進行MALDI-T0FMS質譜 分析，其中有數條肽段經肽指紋圖譜比對后與人免疫球蛋白ga_a-l重鏈恒定區部分序列 匹配，其肽段吻合率達到了 39. 7%以上。為了驗證純化的抗原確為單抗C0C166-9的對應抗 原，本發明通過競爭酶聯免疫吸附實驗、競爭免疫組織化學實驗、競爭免疫細胞化學實驗等 不同方法證明，純化的抗原蛋白確實可競爭抑制C0C166-9與卵巢癌病人腹水蛋白、卵巢癌 組織和卵巢癌細胞蛋白中相關蛋白的結合。為進一步驗證鑒定純化抗原，本發明用純化抗 原免疫小鼠制備獲得了相應的抗血清，通過不同的免疫學實驗表明，用純化抗原免疫小鼠 獲得的抗血清與單抗C0C166-9有同樣的免疫反應特性；而從與C0C166-9反應陽性的卵巢 癌細胞Caov-3中克隆的人免疫球蛋白ga_a-l樣重鏈的恒定區，其原核或真核表達產物也 均能被C0C166-9所識別。這些結果充分表明，單抗C0C166-9的對應抗原為人免疫球蛋白 gamma-1重鏈樣蛋白（IGHGl)。
[0013] 本發明中，還用單抗COC166-9對111例具有五年以上隨訪資料的卵巢癌標本進行 了免疫組化檢測及統計分析，結果表明，卵巢癌組織的CA166-9表達陽性率為53. 1 %，并與 腫瘤復發具有顯著的相關性（P〈〇. 001) !Kaplan-Meier單因素結果顯示，CA166-9表達陽性 患者的總生存期和無病生存期均顯著低于表達陰性患者（P= 0. 026;P= 0. 002) ;Cox多因 素分析顯示，CA166-9可作為影響卵巢癌患者總生存率（HR= 2. 145,P= 0. 027)和無病生 存率（HR= 2. 383,P= 0. 013)的潛在獨立預后指標。從而，本發明提供了CA166-9作為影 響卵巢癌患者總生存率和無病生存率的預后指標中的應用，也提供了針對檢測CA166-9在 卵巢癌組織中的表達的試劑在制備用于卵巢癌病人預后判斷的檢測劑中的應用。
[0014] 本發明中，還研究了CA166-9對卵巢癌細胞系表型的影響，結果表明單抗 C0C166-9能抑制抗原表達陽性卵巢癌細胞Caov-3的體外增殖、迀移和侵襲能力，而對抗原 表達陰性的卵巢癌細胞HOClA和人內皮細胞HMEC的增殖、迀移和侵襲能力無明顯作用。外 源性表達純化的抗原能促進抗原表達陰性卵巢癌細胞HOClA在體外的增殖、迀移和侵襲的 能力；而對抗原表達陽性的卵巢癌細胞Caov-3和表達陰性的人內皮細胞HMEC的相關表型 無明顯影響。從而，本發明還提供了CA166-9在制備促進腫瘤細胞的增殖和/或迀移侵襲 的制劑中的應用，也提供了拮抗CA166-9的拮抗劑（例如抗體）在制備抑制腫瘤細胞生長 和/或迀移侵襲能力的制劑中的應用。本發明的抗原可作為疫苗用于卵巢癌的防治。從 而，本發明還提供了所述CA166-9蛋白或其免疫性片段在制備卵巢癌治療性蛋白疫苗制劑 中的應用。本發明還提供了編碼所述CA166-9蛋白的核苷酸序列在制備卵巢癌治療性核酸 疫苗制劑中的應用。
【附圖說明】
[0015] 圖1 :抗原的親和層析分離純化峰圖。其中，圖片A為腹水抗原洗脫液0D2S。峰圖， 圖片B為Caov-3細胞總蛋白抗原洗脫液OD2fffl峰圖。
[0016] 圖2:WesternBlot鑒定單克隆抗體C0C166-9與純化抗原的反應結果。其中，圖 片A:1為抗原蛋白溶液上樣，正常小鼠IgG為一抗，HP標記的羊抗鼠IgG為二抗；2為抗原 蛋白溶液上樣，單抗C0C166-9為一抗，HP標記的羊抗鼠IgG為二抗；3為抗原蛋白溶液上 樣，BSA蛋白為一抗，HP標記的羊抗人IgG為二抗。圖片B:1為Caov-3細胞總蛋白純化抗 原Iyg上樣，單抗C0C166-9為一抗，HP標記的羊抗鼠IgG為二抗；2為卵巢癌腹水純化抗 原Iyg上樣，單抗C0C166-9為一抗，HP標記的羊抗鼠IgG為二抗。a、b、c、d、e為與單抗 C0C166-9特異反應條帶。
[0017]圖3 :親和層析純化抗原的考馬斯亮藍染色結果。其中，圖片A為Caov-3細胞總 蛋白純化抗原，圖片B為卵巢癌腹水純化抗原。a、b、c、d、e為與單抗C0C166-9特異反應條 帶。
[0018]圖4 :純化抗原指紋圖譜的分析結果。其中，圖片A:卵巢癌腹水純化抗原質譜峰 圖；圖片B:IGHG1蛋白的吻合肽譜圖，紅色的序列即為吻合肽。
[0019] 圖5 :純化抗原和人IgG的ELISA競爭抑制實驗結果。結果顯示，0.5yg/ml純化 抗原或0. 5yg/ml人IgG可有效抑制單抗C0C166-9與包被卵巢癌腹水蛋白的結合，而小鼠 IgG無抑制作用。
[0020] 圖6 :純化抗原和人IgG的免疫組化克爭抑制實驗結果。結果顯不，Iyg/ml純化 抗原或Iyg/ml人IgG可有效抑制單抗C0C166-9與卵巢癌組織的結合，而小鼠IgG無抑制 作用。
[0021] 圖7 :用ProteinA直接進行免疫沉淀鑒定單抗C0C166-9抗原的結果。其中，al: 經ProteinA吸附后的純化抗原蛋白溶液，bl:純化抗原與ProteinA的結合蛋白；a2 :經 ProteinA吸附后的正常人IgG蛋白溶液，b2 :正常人IgG與ProteinA的結合蛋白。
[0022] 圖8 :免疫小鼠多抗血清的ELISA檢測結果。
[0023] 圖9:免疫小鼠多抗血清的免疫組化和免疫細胞化學檢測結果。其中，圖片A:免疫 小鼠多抗血清的免疫組化檢測；圖片B:免疫小鼠多抗血清的免疫細胞化學檢測。
[0024] 圖10 :2個不同克隆的IGHGl樣蛋白的cDNA比對。
[0025] 圖11 :pGEX-4T-l-IGHGl重組質粒的構建及其表達產物與單抗C0C166-9的反應 檢測結果。其中，圖片A:l%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物：M為DNAmarker;1-6 為PCR擴增產物，擴增出約600bp目的片段；圖片B:pGEX-4T-l-IGHGl重組質粒的酶切鑒 定：M為DNAmarker，l-5為不同克隆，用BamHI/XholI雙酶切，釋放約600bp目的片段； 圖片C:原核表達IGHGl蛋白的誘導表達，1-3為誘導表達全菌，其IPTG誘導濃度分別為 0. 25, 0. 5,IyM，4為未誘導全菌，如箭頭所示在55KD處有誘導蛋白表達；圖片D:原核表達 IGH