人ad7c-ntp抗原表位多肽、抗體及其體外診斷試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及人AD7C-NTP抗原表位多肽、抗體及其體外診 斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer'sdisease,AD)又稱老年癡呆癥，是一種原發性中樞 神經系統慢性退行性疾病，以神經元細胞缺失、彌散性大腦皮質萎縮、神經元外老年斑，沉 積、神經元內神經原纖維纏結腳，形成、突觸變性為特征，是老年人的一種常見病。AD的臨床 綜合征是其漫長病程的后期階段，各種致病因子和保護因子在不同時期起著各自的作用， 最終導致的神經病理改變和相應的臨床表現，如記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損 害、執行功能障礙以及人格和行為改變等。由上可見，阿爾茨海默病確診時己存在明顯的神 經元損害，因此預防性治療應在臨床前期盡早實施，如能早期診斷，采取一定的防治措施， 可改善其預后。然而，迄今為止，AD的早期診斷十分困難，原因如下：（1)需做腦脊液檢查， 取材不便；（2)雖然腦脊液中磷酸化的Tau蛋白和其它骨架蛋白增加，但并無特異性，在其 它神經系統疾病中也有變化；而AP42在AD早期無變化，隨病情加重而減少，不便于測定；
[3] 其它各種蛋白質包括酶的測定對診斷無指導意義。
[0003]AD7c_NTP是神經絲蛋白（Alzheimer-associatedneuronalthread protein,AD7c_NTP)家族的一個成員。1997年，Delamonte等首次從AD患者的腦組織中分 離出AD7C-NTP(AD7thcloneneuronalthreadprotein)的cDNA，其編碼產物由 375 個氨 基酸構成，分子質量約為41kD，等電點為9. 89(MonetSM，etal. 1997)，AD7c-NTP蛋白富含 絲氨酸（11. 7% )和脯氨酸（8. 8% )，有4個跨膜區和4個長度在9~23個氨基酸且序列 一致性在83-91 %的重復抗原區，有兩個絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶區陽~48位和272~294 位氨基酸殘基），生物信息學預測認為AD7C-NTP蛋白可能存在個跨膜區，其N端朝向胞質， 屬II型跨膜蛋白。
[0004] 大量研究表明，阿爾茨海默病相關神經絲蛋白（AD7C-NTP)在AD患者的神經元纖 維纏結（NFT)中大量存在，并在患者腦中呈分泌性上調表達，因此，推測它可能與AD的病 理過程有關（MunzarM,etal. 2002;LevyS,etal. 2007;DelaMonteSM,etal. 2001) 〇 增高的AD7c-NTP可從早期或相對嚴重的AD患者腦脊液及尿樣本中檢測到，而且腦脊液 及尿液中AD7C-NTP水平與癡呆的嚴重程度相關（MunzarM，etal. 2001，2002;KahlePJ， etal. 2000)。AD7c-NTP在阿爾茨海默病人的腦脊液及尿液中選擇性地提高，且與AD病理 進程密切相關，表明AD7C-NTP可能在AD的早期診斷中有重要的應用價值（MonetSM,et al. 2001;GhanbariH，etal. 1998)，AD患者尿樣中AD7c-NTP的檢測能達到與腦脊液檢測 同樣的效果，尿樣中AD7C-NTP檢測作為一種無創性的檢查更易被患者接受，也易于在臨床 上推廣。
[0005] AD7C-NTP在正常成人顳葉和額葉皮質的神經元中，用AD7C-NTP的探針可檢測到 的表達，腦皮質和白質的膠質細胞中也可檢測到低水平的AD7C-NTP轉錄產物，但是肺、胰 腺、腎臟、脾臟、胃腸道、肝臟、輸卵管、子宮、卵巢、骨胳肌、甲狀腺、睪丸和胸腺沒有表達。AD7C-NTP在神經元中表達，定位于神經細胞發生的軸突（MonetSM,etal. 1997)。體外實 驗表明，AD7C-NTP基因在轉染的神經細胞的過度表達導致神經炎的發生和細胞的死亡。人 類組織學研究也揭示，AD7C-NTP在腦顳葉和額葉的表達水平比對照組高，并且通過原位雜 交和免疫組化染色發現，在組織學尚完整的變性神經元中出現AD7C-NTP表達的增加。從 而證明，在神經變性的早期即出現AD7C-NTP的異常表達，而且腦脊液中AD7C-NTP的表達 水平與癡呆的嚴重程度呈顯著的相關性（MonetSM,etal. 1997)。在早期或中度AD患者的 皮層神經元，腦組織抽提物，腦脊液中都有升高，并且其含量與癡呆的嚴重程度成正比。
[0006] 1998年Ghanbari等首次用ELISA法測定尿樣本中AD7c-NTP含量，66例AD和 134例非AD患者尿樣中AD7C-NTP含量的檢測結果表明，二者平均濃度分別為2. 5ng/ ml和0. 8ng/ml歲，如果以I. 5ng/ml為標準，對診斷的特異性是91 %，靈敏度是80-85 % (GhanbariH,etal. 1998)。2000 年Fitzpatrich等通過對 58 例AD及 30 例正常對照組 研究表明，AD組的平均濃度是正常對照組的3倍，對診斷特異性為96. 8%，靈敏度為91%。 通過對患者腦脊液和尿液中AD7C-NTP含量的檢測，對AD診斷有較高的特異性和靈敏度， AD7C-NTP作為一種生物標記對的早期診斷很有價值（FitzpatrichJ，etal. 2000)。因此， 有人稱AD7C-NTP實驗為"7CGold"，可見AD7C-NTP對于診斷AD是一項精確的生物標記，而 且對老年人進行風險的常規臨床評價同樣有幫助。
[0007] 因此，研究并確定AD7C-NTP蛋白的抗原表位，獲得其單克隆抗體，并以此為基礎 基于該抗原表位的AD7C-NTP蛋白ELISA診斷方法及其診斷試劑，通過檢測腦脊液和尿液、 血清中AD7C-NTP水平可作為早期AD的初篩試驗，以達到AD患者的早期診斷，具有重要的 意義。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的第一個技術問題是針對現有技術而提供一種抗原性強的人 AD7C-NTP抗原表位多肽。
[0009] 本發明所要解決的第二個技術問題是針對現有技術而提供一種特異性強的人 AD7C-NTP抗體。
[0010] 本發明所要解決的第三個技術問題是針對現有技術而提供一種應用上述人 AD7C-NTP抗體的用于阿爾茨海默病診斷的人AD7C-NTP體外試劑盒。
[0011] 本發明解決第一個技術問題所采用的技術方案為：一種人AD7C-NTP抗原表位多 肽，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1或SEQIDNO:2所述。
[0012] 本發明利用計算機軟件從Genebank(AAC08737. 1)中獲得的人AD7C-NTP蛋白序列 (如SEQIDN0:3所述）中篩選識別表位。表位識別的主要依據是蛋白質或多肽氨基酸序 列的親水性、表面度、柔韌度、Chou-Fasman的螺旋、片狀和轉角、Robson-Garnier的二級結 構及C-和N-末端來預測抗原綜合數據（AntigenicIndex，AI)。根據人AD7c-NTP蛋白序 列，利用網絡資源（如：http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)及生物學軟件，如 DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)，預測它的抗原區（Al)。
[0013] 通過化學合成法制備上述抗原表位：采用Fmoc方法，通過固相合成技術合成制 備，固相肽合成的主要思想是：先將所要合成肽鏈的羧基末端氨基酸的羧基以共價鍵形 式同一個不溶性的高分子化合物（樹脂）相連接，然后以此結合在固相載體上的氨基酸 作為氨基組份，經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組份反應，接長肽鏈，上述步驟 可以反復地多次進行，最后達到所需要合成的肽鏈的長度（該方法的具體步驟參見Eur. J.Immunol. 1994, 24, 3188-3193J.Org.Chem. 1972, 37,3404-3409;《多肽合成》，黃惟德， 陳常慶，北京：科學出版社，1985)。
[0014] 上述抗原表位還可以通過與其它多肽或蛋白形成融合蛋白抗原，融合蛋白抗原可 以通過基因工程方式制得，即通過目標融合蛋白的DNA轉導/轉化至基因工程菌株，如：大 腸桿菌（E.coli)、酵母菌（Saccharomycescerevisiae)中表達并純化，或在中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞、COS細胞、小倉鼠腎（BHK)細胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細胞、小鼠NSO胸腺瘤細胞等 哺乳動物細胞中表達并純化后，得到將其中一種抗原C末端，經由酰胺鍵（amidebond)和 另一種抗原N末端首尾相連的融合蛋白產物（ProteinExpr.Purif.，2008, 59,189-196)。 基因工程方法制備蛋白質抗原的克隆、表達以及純化可通過多種方法進行，具體方法參見 《分子克隆實驗指南》（第三版），科學出版社，2002,第1217-1270頁，適宜的原核表達載體 如pEGX系列原核表達載體（AmershamPharmacia)、pET系列原核表達載體（Novagen)等。
[0015] 本發明解決第二個技術問題所采用的技術方案為：一種人AD7C-NTP抗體，其能特 異性地結合上述的抗原表位。該抗體為單克隆抗體。
[0016] 上述人AD7C-NTP抗體的制備過程如下：
[0017] (1)將上述的AD7C-NTP蛋白抗原表位多肽與載體蛋白結合制備抗原來免疫動物；
[0018] (2)取經免疫的動物脾細胞與瘤細胞融合，得到可穩定分泌抗AD7C-NTP蛋白的雜 交瘤細胞；
[0019] (3)收集、純化雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體，即為抗AD7C-NTP蛋白的單克隆抗 體。
[0020] 本發明解決第三個技術問題所采用的技術方案為：一種應用上述的人AD7C-NTP 抗體的體外診斷試劑盒，該試劑盒可以基于免疫方法對人體組織、細胞或體液中的 AD7C-NTP進行檢測，優選對尿液標本中的AD7C-NTP進行檢測。
[0021] 與現有技術相比，本發明的優點在于：
[0022] (1)本發明中的人AD7C-NTP抗原表位多肽制備的抗原能有效激活分別INF- 丫的 T細胞，預測該抗原表位多肽為人AD7C-NTP蛋白T淋巴細胞和B淋巴細胞重疊表面。
[0023] (2)本發明中的人AD7C-NTP抗原表位多肽（SEQIDN0:1和SEQIDN0:2)具有良 好的抗原性，用其制備的抗原免疫動物能夠產生高度特異性的單克隆抗體。
[0024] (3)本發明中制備的各種人AD7C-NTP抗體能高度特異性的與尿液樣本中的 AD7C-NTP結合。
[0025] (4)本發明中的人AD7C-NTP體外診斷試劑盒能有效檢測尿液中的AD7C-NTP水平， 對阿爾茨海默病患者的早期診斷和臨床治療具有重要意義。
【具體實施方式】
[0026] 以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0027] 實施例1:人AD7C-NTP蛋白中抗原表位的篩選與合成
[0028] (1)多肽序列的選定：利用計算機軟件從Genebank(AAC08737. 1)中獲得的人 AD7c-NTP蛋白序列（如SEQIDN0:3所述）中篩選識別表位。表位識別的主要依據為： 蛋白質或多肽氨基酸序列的親水性、表面度、柔韌度、Chou-Fasman的螺旋、片狀和轉角、 Robson-Garnier的二級結構及C-和N-末端來預測抗原綜合數據（AntigenicIndex， Al)。根據人AD7c_NTP蛋白序列，利用網絡資源(如：http://www.cbs.dtu.