一種大米清蛋白和球蛋白混合蛋白的提取方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種清蛋白和球蛋白混合蛋白的提取方法。
【背景技術】
[0002]大米作為人類最重要的一種食物資源，其蛋白質是全球公認的一種低致敏性的蛋白，蛋白中的必需氨基酸種類齊全，生物效價高。因而大米蛋白被認為是一種具有高開發價值的植物蛋白資源，受到了全世界研究者們的關注。但是與其他谷物的蛋白質相比，大米蛋白的研究成果卻很少。原因在于不同于其他谷物的蛋白質，幾乎所有的水稻胚乳的蛋白均不溶于水、鹽溶液和酒精，我們稱之為谷蛋白。因此，大部分的研究記錄，總是圍繞堿提取大米蛋白質的混合物，其中含量僅次于谷蛋白的球蛋白及清蛋白的研究則更少，但是關于其他植物的球蛋白有很多研究，證明其具有降低膽固醇水平、預防心血管疾病和骨質疏松癥功效，對腎臟病及高血壓的預防也十分有益。所以研究大米清、球蛋白分離提取和功能性質，對于開發和利用大米蛋白質以及促進我國大米深加工都具有積極的現實意義。
[0003]大米球蛋白含有較高的谷氨酸、精氨酸和含硫氨基酸。它的必須氨基酸成分與FA0/WH0給10?12歲兒童的營養需求相類似，目前它以可以作為一個良好的蛋白質食物來源，如作為低過敏性嬰兒配方或代替昂貴的動物蛋白。大米球蛋白主要由26kDa和16kDa，及幾個小分子片段組成。26kDa多肽，稱為α-球蛋白，是主要的水稻球蛋白成分，約占總球蛋白的70%，其pH值的等電點為4.5。目前對于植物來源球蛋白的提取一般采用兩種工藝:即傳統的Osborne分級分離-透析工藝和鹽溶酸沉工藝。然而，由于傳統的Osborne分級分離-透析工藝具有工序繁雜、耗水量大、產品得率低等缺點，所以，大規模提取大米清、球混合蛋白的工業化生產受到一定的限制。同時，鹽溶酸沉法在提取蛋白時，對PH的要求較高，大米蛋白在分離時易混入不需要的蛋白，并具有操作繁瑣等弊端。
【發明內容】
[0004]本發明是要解決現有大米中清蛋白或球蛋白較難分離提取的問題，提供一種大米清蛋白和球蛋白混合蛋白的提取方法。
[0005]本發明大米清蛋白和球蛋白混合蛋白的提取方法，按以下步驟進行:
[0006]一、將大米研磨成米粉；
[0007]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得到脫脂米粉；
[0008]三、將脫脂米粉用鹽溶法得到蛋白提取液；
[0009]四、對蛋白提取液用三氯乙酸溶液將蛋白沉淀；
[0010]五、將沉淀真空冷凍干燥，即得大米清蛋白和球蛋白的混合蛋白。
[0011]大米中清蛋白和球蛋白的含量較少，兩者加和不超過總蛋白含量的2%，單獨從大米中提取清蛋白或球蛋白中任何一種，其提取率均較低，而且易混入不需要的雜蛋白。針對這一技術難題，本發明創造性的從大米中提取清蛋白和球蛋白的混合蛋白，使用三氯乙酸蛋白沉淀劑直接將蛋白沉淀，不需要調節pH，減少操作步驟，減少損失。通過SDS-PAGE分析，基本沒有醇溶蛋白、谷蛋白干擾，得到以球蛋白為主，含少量清蛋白的清球蛋白混合物。此提取方法能夠充分減少其他雜蛋白的影響，較單一提取清蛋白或球蛋白的提取工藝更為簡單、快捷，并且，所提取的蛋白純度及提取率更高。如需要清蛋白或球蛋白中任意的單一蛋白，則可以從本發明所提取的清球混合蛋白中進一步提取，依據需求增加水洗或鹽水脫洗即可。
[0012]本方法可以簡單、快速、高效提取大米清球混合蛋白，適于工業化生產應用，所提取的大米清球蛋白提取率高達97%以上，大米清球混合蛋白純度可達90%以上。因此，本發明的廣泛應用將有效地提升我國大米蛋白的研究水平，解決大米蛋白的利用率非常低，資源浪費嚴重情況，為大力開發以大米為原料的植物性蛋白質，深入發展我國新型功能性蛋白資源，提供新途徑。
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1中3次提取的混合蛋白電泳圖；圖2為實施例1三次提取大米清球混合蛋白的蛋白提取率；圖3為應用水、鹽混洗的傳統方法提取大米清球混合蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
【具體實施方式】
[0014]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0015]【具體實施方式】一:本實施方式大米清蛋白和球蛋白混合蛋白的提取方法，按以下步驟進行:
[0016]—、將大米研磨成米粉；
[0017]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得到脫脂米粉；
[0018]三、將脫脂米粉用鹽溶法得到蛋白提取液；
[0019]四、對蛋白提取液用三氯乙酸溶液將蛋白沉淀；
[0020]五、將沉淀真空冷凍干燥，即得大米清蛋白和球蛋白的混合蛋白。
[0021]本實施方式在鹽溶酸沉的基礎上進行改良，將難以分離或分離之后會大大降低球蛋白提取率的清蛋白一起提取，使用三氯乙酸蛋白沉淀劑直接將蛋白沉淀，不需要調節PH，減少操作步驟，減少損失。通過SDS-PAGE分析，基本沒有醇溶蛋白、谷蛋白干擾，得到以球蛋白為主，含少量清蛋白的清球蛋白混合物，減少其他雜蛋白的影響。本方法提取出的大米清蛋白和球蛋白的混合蛋白可以為大米蛋白功能性研究提供基礎，如與脂肪的高結合能力、乳化能力、高表面疏水性、氨基酸組成、降血糖、降血脂、防糖尿病和動脈硬化等一系列生物活性功能，為加工成營養保健品和一些生物藥制品提供理論基礎。
[0022]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中將大米研磨成米粉的具體方法為:用粉碎機粉碎新鮮大米，每次10?15s，共30?40次。其它與【具體實施方式】一相同。
[0023]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟二中將米粉用正己烷脫脂的具體方法為:
[0024]A、將米粉與正己烷按照lg:4?6mL的比例混合，室溫攪拌lh，靜置lh，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0025]B、重復步驟A2?4次，將收集的沉淀于30°C水浴中晾干，得到脫脂米粉。其它與【具體實施方式】一相同。
[0026]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟三中將脫脂米粉用鹽溶法得到蛋白提取液的具體方法為:
[0027]①將步驟二得到的脫脂米粉與B溶液按照lg:10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振蕩8h，離心后收集上清液和沉淀；
[0028]將上述步驟①的沉淀與B溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振蕩8h，離心后收集上清液和沉淀；
[0029]將上述步驟②的沉淀與B溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振蕩4h，離心后收集上清和沉淀；其中離心的條件均為:1?6°C，10000g，20min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0030]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】四不同的是:所述B溶液為50mM且pH6.5的KH2PO4-NaOH緩沖液，其中含有0.5MNaCl和ImM EDTA_2Na。其它與【具體實施方式】四相同。
[0031]所述B溶液的配制方法為:50mmol的KH2PO4溶解在950mL去離子水中，調pH至6.5，再加入0.5mol NaCl和lmmol EDTA_2Na，攪拌至充分溶解，定容至1000mL。
[0032]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟四中將蛋白提取液用三氯乙酸將蛋白沉淀的具體方法為:
[0033]A、將步驟三中所有收集到的上清液合并，加入濃度為10%?12% (w/v)的三氯乙酸溶液，上清液與三氯乙酸的體積比為3:10，避光條件下，O?4°C反應15?20min ;B、離心棄掉上清液，得蛋白沉淀；其中離心的條件為?6°C，10000g，20min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0034]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟五中真空冷凍干燥的條件為:真空度< 15Pa，冷阱溫度為-60?_50°C，樣品溫度-30?_20°C，凍干時間為20?24h。其它與【具體實施方式】一相同。
[0035]為驗證本發明的效果，進行以下試驗:
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