氨甲環酸的兩親性衍生物及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因治療技術領域，具體涉及一種氨甲環酸的兩親性衍生物及其用 途。
【背景技術】
[0002] 基因治療（gene therapy)是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償基因缺 陷和異常，從而達到治療目的的一項革命性新技術。基因治療是以現代分子生物學技術為 基礎發展起來的，是一種治愈由基因異常引起的疾病的新方法。1990年美國研究者成功將 基因治療應用到臨床試驗，此舉掀起了科學研究者們對基因治療的研究熱潮。之后的近十 年間，基因治療對多種疾病的治療取得了顯著性進展。
[0003] 常見的基因藥物有質粒DNA (plasmid DNA，pDNA)、反義寡核苷酸（antisense 0DN)、 小干擾RNA(siRNA)和小發卡RNA(shRNA)。它們都是以聚核糖核酸結構為骨架，以基因或 基因表達通路為作用靶點，通過調節靶細胞中基因表達，來實現治療作用的。不同類型的核 酸，在分子基因水平起的效應也不同。
[0004] siRNA (Small interfering RNA)，又稱為小干擾RNA，是長度20到25個核苷酸的 雙鏈RNA。通過與之序列互補的mRNA相結合，促使mRNA降解，介導轉錄水平的基因表達抑 制，從而誘使細胞表現出特定基因缺失的表型。siRNA的調控機制是通過互補配對來對相應 靶位基因的表達進行沉默，因此具有高度的特異性。所以將其作為治療藥物，具有廣闊的發 展前景，對于惡性腫瘤、HIV等一系列病癥的治療具有重大意義。
[0005] 基因治療的關鍵是將基因藥物體內輸送到靶細胞，使其發揮作用。外源基因藥物 通常具有分子量大、易被核酸酶降解的特點。若將其直接導入體內，會被體內核酸酶降解， 失去治療作用。雖然近年來發展出了多種基因轉移技術，如：細胞學、病毒載體、直接注射 法等。但研究表明，只有利用載體才能幫助基因藥物成功通過復雜血液環境，在靶細胞內富 集，發揮作用。因此，高效、安全的基因遞送系統是基因治療發展亟待解決的瓶頸問題。
[0006] 基因載體在運送基因的時候要經歷多個復雜的過程：通過血液循環到達靶細胞， 細胞攝取，內涵體的逃逸，胞內運動，載體釋放基因物質。其主要障礙主要是復雜血液環境 的細胞外障礙和溶酶體酶降解的細胞內障礙。因此尋找良好的基因載體，使得靶基因到達 靶點發揮效用，是基因載體研究者亟待解決的問題。
[0007] 目前，多樣性、無免疫原性及易于控制生產的非病毒載體系統近年來備受關注，并 在很多治療領域有所應用。常用的非病毒載體系統主要是脂質（cationic lipids)載體。
[0008] 陽離子脂質的正電荷通過靜電作用與帶負電的基因藥物結合，從而將基因物質濃 縮包裝成較小粒徑的粒子。復合物較小的粒徑降低了被體內巨嗜細胞識別、吞噬、清除的機 會，提高了藥物的體內生物利用度。同時，針對于腫瘤組織，復合物較小粒徑更容易利用滲 透和滯留效應從血管內皮細胞間隙透過進入腫瘤實質，增加在腫瘤組織的藥物聚集。在轉 染方面，由于細胞表面略微帶有負電，帶正電的脂質體更容易吸附到細胞表面，通過內吞等 機制進入細胞，大大增加了脂質體的轉染能力。
[0009] 目前陽離子脂質作為基因載體因其結構簡單、操作簡便、生物安全性高等特點成 為了目前應用最為廣泛的非病毒載體，但大部分制備過程復雜，不易進行放大生產。因此本 發明嘗試利用氨甲環酸，以其為結構基礎，將其兩親性衍生物作為基因藥物的載體系統。此 類衍生物合成步驟簡單，原材料簡單易得，同時，能較好遞送基因藥物，成功解決了上述問 題，達到了較好的基因治療效果。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的在于克服上述現有技術存在的缺點，提供了一種氨甲環酸的兩親性 衍生物及其用途；該衍生物是基于氨甲環酸結構為基礎的一系列兩親性衍生化合物。本發 明的兩親性衍生化合物的含氮頭基在不同PH下具有不同的電離狀態，其中在較低pH下，如 PH4-5,其帶正電。從而其制備而成的膠束及脂質體，可以與帶負電的基因藥物復合，能形成 粒徑較小，分布均勻的復合物納米粒子。同時，化合物的含氮頭基在pH7. 4條件下不帶電或 帶負電，這樣使得復合物在PH7. 4環境下不帶電或帶負電，降低了與體內血液環境中帶負 電蛋白吸附的機會，增加了脂質復合物的體內穩定性，減小因過多正電荷引起的細胞毒性。 本發明提供的脂質體，可將熒光素酶siRNA體外高效遞送到人非小細胞肺癌H1299-Pgl3細 胞內，特異性抑制基因表達。同時載體系統可以體內特異性轉載熒光基因藥物進入正常小 鼠肝臟細胞。
[0011] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0012] 第一方面，本發明涉及一種氨甲環酸的兩親性衍生物，其結構式如式（I )所示：
基，R2為長碳鏈烷基或烷烴基。也可以表示為：Rl為碳鏈或亞油酸鏈，R2為碳鏈或亞油酸 鏈。該結構如具有以下特點：R3and R4-氨基-CH2-環己烷基-酯鍵-Rland R2。
[0014] 優選地，所述Rl為含12~18個碳原子的長碳鏈烷基或烷烴基，R2為含12~18 個碳原子的長碳鏈烷基或烷烴基。
[0015] 更優選地，所述Rl為第九個碳原子位置上為雙鍵或第九、十二個碳原子位置上為 雙鍵的長碳鏈烷烴基。
[0016] 更優選地，所述R2為第九個碳原子位置上為雙鍵或第九、十二個碳原子位置上為 雙鍵的長碳鏈烷烴基。
[0017] 上述氨甲環酸的兩親性衍生物包括如下結構：
[0018]
[0023] 第二方面，本發明還涉及一種上述的氨甲環酸的兩親性衍生物的制備方法，所述 方法包括如下步驟：
[0024] A、在四氫呋喃催化劑、紅鋁溶液的甲苯溶液存在的條件下，含碳原子12-18的直 鏈脂肪酸在室溫下發生還原反應，得中間產物醇2 ;
[0025] B、在三乙胺、4-二甲氨基吡陡、甲烷磺酸酐催化劑的作用下，中間產物2在0°C下 發生磺酸酯化反應，得中間產物3 ;
[0026] C、在二甲基甲酰胺、溴化鋰催化劑作用下，中間產物3在45°C下反應得到中間溴 化物4 ;
[0027] D、在鎂、無水乙醚、甲酸乙酯催化劑作用下，中間產物4在40°C格式反應生成中間 產物5 ;
[0028] E、在氫氧化鈉、四氫呋喃作用下，中間產物5在65°C下發生水解反應生成中間產 物6 ;
[0029] F、在催化劑甲酸、甲醛作用下，氨甲環酸在80°C下發生脫氫反應生成中間產物 10;
[0030] G、在N，N-二異丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰 二亞胺鹽酸鹽催化劑作用下，中間產物10與中間產物6在30°C下反應，即得所述兩親性衍 生物。
1-7中任一整數，且第6個碳原子處為單鍵或雙鍵，第9個碳原子處為單鍵或雙鍵。
[0032] 第三方面，本發明還涉及一種含有上述兩親性衍生物的脂質體，所述脂質體包 括所述氨甲環酸的兩親性衍生物、膽堿、膽固醇；所述脂質體中膽堿的重量百分比含量為 10%~50%，膽固醇的重量百分比含量為10%~30%。
[0033] 優選地，所述膽堿為二棕櫚酰磷脂酰膽堿。
[0034] 第四方面，本發明還涉及一種上述的脂質體的制備方法，所述方法包括如下步 驟：
[0035] A、將所述氨甲環酸的兩親性衍生物的乙醇溶液、膽堿乙醇溶液、膽固醇乙醇溶液 混合，形成脂質乙醇溶液；
[0036] B、將所述脂質乙醇溶液加入到pH〈5. 0的HEPES緩沖液中，攪拌，制得脂質體混懸 液；
[0037] C、將所述脂質體混懸液在pH〈5. 0的HEPES緩沖液透析，去除乙醇；即得所述脂質 體。
[0038] 步驟B中，脂質體混懸液中含30wt. %乙醇。步驟C中，透析是在4°C下透析4h。
[0039] 第五方面，本發明還涉及一種上述的脂質體在制備基因藥物輸送載體中的用途， 所述脂質體包載DNA、RNA、透明質酸或多肽。所述基因藥物為DNA、RNA、透明質酸或多肽。 該脂質體具有幫助基因藥物穿過細胞外障礙和細胞內障礙的能力。
[0040] 第六方面，本發明還涉及一種脂質/基因復合物，所述脂質/基因復合物是由上述 的脂質體包載基因生物分子而組成的。其包封率在30%以上。該基因生物分子包括DNA、 RNA、透明質酸或多肽。
[0041] 第七方面，本發明還涉及一種上述的脂質/基因復合物的制備方法，所述方法包 括如下步驟：
[0042] A、將所述氨甲環酸的兩親性衍生物的乙醇溶液、膽堿乙醇溶液、膽固醇乙醇溶液 混合，形成脂質乙醇溶液；
[0043] B、將所述脂質乙醇溶液加入到pH〈5. 0的HEPES緩沖液中，攪拌，制得脂質體混懸 液；
[0044] C、在所述脂質體混懸液中加入基因生物分子的DEPC水溶液，37°C孵育l_2h ;
[0045] D、在pH〈5. 0的HEPES緩沖液透析，去除乙醇；繼續在PBS溶液透析，調整體系pH 至中性，即得所述脂質/基因復合物。
[0046] 步驟B中，脂質體混懸液中含30wt. %乙醇。步驟D中，在HEPES緩沖液中透析是 在4°C下透析4h ;在PBS溶液中透析是在4°C下透析12h ;其中PBS溶液的pH值為7. 4。步 驟D中，優選調整體系pH至7. 4。
[0047] 與現有技術相比，本發明的有益效果如下：
[0048] 1、本發明基于氨甲環酸結構為基礎，制備的兩親性衍生化合物，從而改善優化了 傳統基因遞送系統合成步驟復雜，不易放大生產的問題；
[0049] 2、本發明基于氨甲環酸結構為基礎，制備的兩親性衍生化合物，增加了脂質體的 穩定性；
[0050] 3、本發明的兩親性衍生物制備而成的脂質體，與基因藥物siRNA復合后，能形成 粒徑較小，分布均勻的復合物。同時在pH7. 4環境下不帶電或帶負電，增加了脂質復合物的 體內穩定性，減小因過多正電荷引起的細胞毒性，其可以作為基因藥物載體