動物中性成熟的控制的制作方法
【專利說明】
[0001] 對相關申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2012年10月30日提交的美國臨時申請第61/720, 187號和于 2013年8月27日提交的美國臨時申請第61/870, 510號的優先權，其在此通過引入并入本 文。
[0003] 關于聯邦政府支持的研究的聲明
[0004] 本文所記載的工作的方面由國立健康研究所撥款號1R43RR033149-01A1和 USDA-國立食品和農業研究所生物技術風險評估項目競爭撥款號2012-33522-19766支持。 美國政府可具有本發明的某些權利。 發明領域
技術領域 [0005] 涉及生產和飼養動物（包括家畜）的方法，其中家畜是遺傳修飾的，從而 它們保持性不成熟的，除非經過處理而變得成熟。
[0006] 發明背景
[0007] 在優化育種和分娩方面，常規家畜飼養實踐關注性成熟在家畜中的作用。例如，對 于牛群而言，已知在性成熟時期管理小母牛可以顯著地影響其終生的生產能力且應該精心 策劃。性發育的最佳過程已經成為許多研究的對象，傳統知識認為早于第一年繁殖和產犢 的小母牛具有更佳的生存期產量，以及生產總花費的降低成本高達初始產犢。
[0008] 發明概述
[0009] 本文提供了 一種與傳統實踐不同的方法，該方法無限期地、永久地延緩家畜 (livestock)的性成熟，或直到當經過處理時才性成熟。已經用這些方法處理魚和豬，這些 處理的結果在本文中列出，包括活的克隆的建立者動物（founder animals)。高效和精確的 基因編輯在某些商業上重要的基因座中得以實現。編輯的效率足夠高使得無需連鎖的選擇 標記即可做出這些改變。
[0010] 本發明的一個實施方式為一種含有基因組的遺傳修飾的家畜動物，所述基因組 包含性成熟選擇性的神經內分泌基因的失活（inactivation of a neuroendocrine gene selective for sexual maturation)，該失活的基因阻止動物性成熟。
[0011] 本發明的一個實施方式為一種含有基因組的遺傳修飾的家畜動物，所述基因組在 性成熟選擇性的神經內分泌基因的失活上是雜合的，其中失活基因純合的子代因而被阻止 成為性成熟（wherein progeny homozygous for the inacitivated gene are thereby prevented from becoming sexually mature)〇
[0012] 本發明的一個實施方式為一種生產家畜動物的方法，包括向選自由家畜細胞和家 畜胚胎組成的組的生物（orgainsm)中引入試劑（agent)，其特異結合細胞染色體革EU立點并 導致雙鏈DNA斷裂以失活性成熟選擇性的神經內分泌基因，且所述試劑選自由TALEN、鋅指 核酶和重組酶融合蛋白組成的組。
[0013] 本發明的一個實施方式為一種飼養家畜動物的方法，包括向動物施用藥劑以使 動物性成熟，該藥劑補償動物性成熟的遺傳失能（with the agent compensating for a genticinabilityoftheanimaltosexuallymature)〇
[0014] 下列專利申請在此通過引用以所有目的并入本文；發生沖突時，本說明書約束： US2010/0146655、US2010/0105140、US2011/0059160、US2011/0197290 和 US2013/0117870。
[0015] 附圖簡述
[0016]圖1.是生產和使用為了控制成熟而遺傳修飾的動物的方法的示例圖。
[0017] 圖2 :通過測序確認Belgian Blue的基因滲入（introgression)。圖示了 Wagyu野 生型⑶F8和Belgian Blue模板（BB-HDR)。用位于同源臂外部的引物（c和d)對5個PCR 陽性集落進行PCR，接著進行克隆及用引物b'測序。與野生型序列的比較證實了在5個集 落的4個中，存在預期的Belgian Blue等位基因（雜合）特征性的11個堿基對的缺失。
[0018] 圖3:使用mRNA編碼的TALENs和ssODN將天然存在的等位基因從一個物種 (species)基因滲入到另一個物種。皮埃蒙特肌肉生長抑制素（Piedmontese Myostatin) 等位基因C313Y被基因滲入Ossabaw中。
[0019] 圖4:革巴定基因（targeted gene)的修飾。每個圖表（chart)展示了革巴向成纖維 細胞中特定基因座的結果（即，ssIL2RG;"ss"代表野豬（Sus scrofa)，且"bt"代表普 通牛（Bos taurus))。（插圖）寡核酸（oligo)模板的圖表（diagrams)，其中陰影框代表 TALEN-結合位點且間隔子以白色示出。通過RFLP分析在第3天和第10天檢測HDR (Day3 % HDR和DaylO% HDR)。每個棒展示了三次重復的平均值和SEM。
[0020] 圖5 :TALEN刺激的HDR等位基因的序列分析。源于TALEN mRNA和經寡核酸轉染 的細胞群的靶位點側翼的PCR擴增子（共200-250bp)通過ILLUMINA測序儀測序。每樣本 的總讀取計數從10, 〇〇〇到400, 000。完美的預期的HR讀數計數相對于野生型測序數據被 繪制為插入（小圖a)和SNP等位基因（小圖b)。在下面表明靶基因座、時間點和是否BMs 包括在寡核酸中。小圖c)對bt⑶F8和p65的讀數（reads)分選靶SNP的摻入，然后分類 目的的（iSNP)與那些具有額外突變的（iSNP+Mut)，并針對總讀數進行作圖。
[0021] 圖6 :具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆豬。㈧分別源于DAZL-和APC-修 飾的landrace和Ossabaw成纖維細胞的克隆小豬的RFLP分析。DAZL建立者（founder)的 預期RFLP產物為312、242和70bp (空心三角形），以及對APC的預期RFLP產物為310、221 和89bp (實心三角形）。WT和DAZL建立者之間312bp條帶大小的差異反映了預期的缺失 等位基因。（B)序列分析確定了 HDR等位基因存在于8個DAZL建立者中的3個中，以及6 個APC建立者中的6個中。供體模板（HDR)中的BMs以箭頭表示，且插入的堿基封閉在塊 中。頂端WT序列中的粗體字表示TALEN結合位點。
[0022] 圖7 :豬GPR54和用于敲除的基因靶向策略的圖示描述于小圖a中。經設計以結 合外顯子3的TALENs (下劃線的文字）和經設計以引入提前終止密碼子和Hindlll限制位 點的寡核酸同源模板（HDR)共轉染。小圖b:將2微克的TALENs編碼mRNA加0. 2nMol的 HDR模板轉染到作為克隆生長的豬成纖維細胞中，并通過Hindlll RFLP檢測分析同源性依 賴性修復。PCR結果顯示：每個道代表一個集落。231和158bp的剪切產物代表同源性依賴 性修復。具有389bp親本條帶的集落歸類于HDR敲除等位基因雜合子（空心三角形），不具 有389bp親本條帶的的集落歸類于HDR敲除等位基因的純合子（實心三角形）。
[0023] 圖8:小圖a:編碼羅非魚親吻肽（tilapia kisspeptin)的mRNA的核苷酸和推導 的翻譯氨基酸序列。kiss基因的組織結構是保守的，且包含兩個編碼外顯子，一個編碼信號 肽和親吻肽前體的一部分，另一個編碼包含親吻肽10序列的前體剩余部分。用三角形符號 表示內含子的位置。示出了用于靶區域（442bp)PCR擴增的正向和反向引物的位置。用黑色 和灰色框表示兩個修飾的TALEN對（即Kissl. la和Kissl. lb)的結合位點。小圖b顯示了 靶定的kiss基因組區域的圖示，所述區域顯示親吻肽10生物活性肽以及每個kissl. la和 lb TALENs識別位點的位置。也顯示了用于插入缺失（indels)分析的PCR(442bp)和qPCR 引物對（138bp擴增子）。
[0024] 圖9 :小圖a :編碼羅非魚GPR-24mRNA的核苷酸和mRNA的推導翻譯的氨基酸序列。 kissr基因的組織結構是保守的，并包含五個編碼外顯子。用三角形符號表示所有4個內含 子的位置。KissRE2和KissRE3TALENs靶向的基因座分別位于編碼外顯子2(白色框）和 3(灰色框）中。在框中顯示了有義左和反義右TALENs識別位點的位置。小圖b顯示了羅 非魚GPR-24基因組區域的圖示，其顯示了內含子（Stroked goalpost)、包含kissRE2和RE4 基因座（白色框）的編碼外顯子2和3(黑色箭頭）的位置。還顯示了用于PCR和qPCR分 析的引物位置以及相應的擴增子的大小。
[0025] 圖10:包含kiss和kissRE3基因座的100-120bp qPCR產物的解鏈分析。小圖a 和b顯示了擴增子的解鏈曲線，所述擴增子產生自提取自用kissl. la和kissRE3TALENs對 處理的魚鰭的gDNA。普通箭頭指示解鏈數據圖表（profile)(小圖a)或（小圖b)，其顯著 不同于那些獲得自未處理的魚（虛線箭頭）的，并對應于候選突變魚kiss#41，RE3#1，4,6 和11。小圖c :從TALEN處理的魚#41PCR擴增含有靶向Kiss基因座的442bp基因組片段。 PCR產物克隆到T0P0 2. 1TA載體中，且手工挑選轉化子集落用于直接QPCR分析。普通箭頭 指向挑選的來自于集落的解鏈曲線圖形，所述集落含有在kiss基因座上的不同缺失。小圖 d :為了更好地觀察所克隆的各種突變，我們對我們的QPCR集落進行作圖，在Cts相對解鏈 溫度的散點圖上進行篩選，其中每個克隆由數據點（x，y)表示，其中x表示其Ct以及y表 示其解鏈溫度。所述圖表示包含擴增自魚RE3#4的702bpPCR片段的集落。低于野生型序 列的解鏈溫度均含有kissRE3擴增子，所述擴增子在靶位點具有各種突變。Cts :循環閾值。
[0026] 圖11:由工程化的TALENs在kiss基因（位點kissl. la)(小圖a)和kissR基因 位點（KissRE3)(小圖b)誘導的體細胞突變的描述。野生型序列示于每個小圖的頂端，其 中以粗體深灰色尚殼顯不有義左和反義右TALEN識別兀件位點并以文本下劃線尚殼顯不 有義間隔子。缺失用破折號顯示以及插入用淺灰高亮的小寫字母顯示。由每個插入缺失 突變引起的長度的凈變化在每個序列的右側（+，插入；一，缺失）。一些改變具有序列的缺 失和插入兩種。分離每個突變的等位基因的次數顯示于括號中。
[0027] 圖12:小圖a:來自KissRE3#ll系的兩個同胞子代（sibling progeny)的PCR產 物的選擇性的測序色譜。這些圖表示同時閱讀kissRE3突變和WT等位基因突變的存在。 框表示與突變和WT等位基因匹配的核苷酸，以及箭頭指示序列發生分歧并由此缺失在此 開始的位置。為了表征突變，我們分析了序列中獨特核苷酸閱讀的模式（其中色譜顯示上 述背景非重復的核苷酸閱讀）。通過移碼（shift)WT序列和增加缺失序列的大小，我們發 現7bp和5bp缺失在這些色譜上重現了單核苷酸閱讀的模式。小圖b :所有遺傳插入缺失 突變的描述，所述突變工程化的TALENs在kiss基因（kissl. la位點，頂部）和kissr基因 (KissRE3位點，底部）誘導。野生型序列示于頂部，并用粗體字淺灰高亮顯示有義左和反義 右TALEN識別元件以及用下劃線文字高亮顯示有義間隔子。缺失用破折號顯示。由每個插 入缺失突變引起的長度上的凈變化在每個序列的右側（一，缺失）。分離每個突變的等位基 因的次數示顯示于括號內。小圖C:在kiss和kissRE3位點處發現的最為嚴重的損傷的描 述。位于kissl.la基因座上18nt的缺失導致6AA的缺失（下劃線），其中的3個來自親吻 肽10活性肽的核心序列（灰色高亮）。kissRE3基因座上的7nt的缺失（下劃線）導致基 因產物的顯著改變，所述產物具有緊接著終止密碼子的兩個氨基酸的替換。獲得的蛋白在 C-末端由215氨基酸截斷。
[0028] 發明詳述
[0029] 期望以節約環境和能源來源的方式生產家畜。性未成熟的動物通常比成熟或正處 于成熟的動物每鎊重量消耗更少的食物。一般而言，在成熟前家畜并未達到期望的重量。然 而文本所列出的是在成熟前能夠生長到期望的大小的動物。
[0030] 事實上，本文記載了方法，其中動物根本不能性成熟。其可以生長經過正常的成熟 年齡而不經歷青春期。性未成熟的動物是不育的。由于有性繁殖是成本有效的，并且即使 是輔助的生殖技術（ATRs)也需要成熟的動物來提供卵子和精子，因此不育動物的有效率 的生產是一項顯著的挑戰。在一些實施方式中，家畜動物不進入青春期并保持永久的性未 成熟，除非特異地處理以使其進入性成熟。在處理誘導成熟后，這種動物可用于育種。
[0031] 生產不能成熟的家畜的優勢在于其不能繁殖。例如，在有性育種或遺傳修飾的魚 中，消除了它們意外流入野外的擔憂。類似修飾的其它動物也將不能繁殖，從而可以銷售具 有有價值的遺傳性狀的動物而不必擔心買家對動物的不受控制的育種。此外，在很多農場 動物（如牛、禽類和魚）中，不育將增加產率和肉質，改善脂肪含量、色素和質地。術語母牛 (cow)是牛（cattle)的口語術語；牛是大型有蹄類動物，是牛屬（genusBos)中最廣泛分布 的物種。母牛（cow)或牛（cattle)指牛（Bosprimigenius)的成員。且在魚的情況中，通 過生長保存能量而不是性腺發育和性分化，不育的魚在培養中應表現出更高的性能。目前， 通過倍性操作（ploidymanipulation)(特別是三倍性，其添加了一套額外的染色體）不育 是唯一的商業上可用于水產養殖者的可升級技術。然而不一致的結果引發了關于該技術效 率的關注。另外，一般來說，三倍體誘導經常負面影響處理群體的存活和/或表現。且該技 術的應用是高勞動強度的、邏輯上是復雜的和昂貴的。
[0032] 本發明的一個實施方式為一種含有基因組的遺傳修飾的家畜動物，所述基因組包 含性成熟選擇性的神經內分泌基因的失活，所述基因的失活阻止動物成為性成熟。所述基 因選擇地針對性成熟過程，如果動物基因敲除，該動物將與野生型動物在其發育上進行比 較直到野生型動物經歷性成熟的時間為止，所述的發育通過測量大小和體重。術語基因指 基因組序列上可定位的區域，對應于遺傳單元，其與調控區、轉錄區和或其它功能序列區域 相關。本文所使用的術語基因包括功能序列區域以及那些編碼蛋白或其它因子的部分。本 文所使用的術語敲除，指直接或間接破壞基因，其失活所產生的蛋白的功能或消除蛋白產 品的生廣。
[0033] 由于遺傳修飾針對特定基因或基因產物以阻止性成熟，因此成熟所需的因素是已 知的并且常規能提供的。
[0034] 性成熟選擇性的神經內分泌基因
[0035] 可通過阻斷性成熟選擇性的神經內分泌基因來阻止動物的性發育。當下丘腦開始 分泌促性腺激素釋放激素（GnRHl)時，啟動了性發育、生長加速和腎上腺成熟。基因GnRHl 編碼GnRHll前體。在哺乳動物中，線性的十肽終產物通常自92氨基酸的前激素原合成。促 性腺激素釋放激素（GnRHl)，也被稱為促黃體生成激素-釋放激素（LHRH)和luliberin而 知曉，其負責促卵泡激素（FSH)和促黃體生成激素（LH)的釋放。GnRHl屬于促性腺激素釋 放激素家族。本發明的實施方式包括在家畜動物中失活GnRHl。可將促性腺激素釋放激素 或類似物施用給動物以使其性成熟。跨多個物種的GnRHl的序列是已知的，如普通牛（Bos Taurus)的基因 IDs 768325、雞（Gallus gallus)的 770134 或豬（Sus scrofa)的 397516。 GPR54,也被稱為親吻肽受體（還被稱為GpR54、KiSSR、KiSSlR、ki SSR等），其結合至激素親 吻肽（之前稱為metastin)。親吻肽是來自KiSSl基因的產物（還稱為Kiss、Kissl、KiSS、 kissl等）。親吻肽-GPR54信號（signaling)具有啟動GnRHl分泌的作用。親吻肽是一種具 有多種功能的RFamide神經肽，包括各種全身生理系統并在所有水平的生殖軸一腦、垂體、 性腺（BPG)和附屬器官中起作用。親吻肽可直接刺激GnRH釋放（Messager et al.，2005)、 傳達類固醇激素正和負反饋信號至GnRH神經元、作為青春期起始的直接參與細胞生長調 節（gatekeeper)，和傳達光周期信息。
[0036] 本發明的實施方式包括在家畜動物中失活基因GPR54和/或KiSSl。可施用親吻 肽以彌補KiSSl的喪失并由此實現性成熟。或，抑制KiSSl和/或GPR54,并將促性腺激素 釋放激素施用到動物中使其性成熟。另一實施方式為通過插入顯性負調控GPR54到家畜動 物的基因組中來失活親吻肽-GPR54間的相互作用。顯性負調控GPR54的表達干擾了受體的 下游信號轉導，阻止信號傳播和GnRHl的釋放。跨多個物種的GPR54的序列是已知的，如人 (Homo sapiens)的 84634、斑馬魚（Danio rerio)的 561898 或豬（Sus scrofa)的 733704。 跨多個物種的Kissl的序列是已知的，如普通牛（Bos Taurus)的615613、豬（Sus scrofa) 的 733704 或綿羊（Ovis aries)的 100294562。
[0037] Gpr54/Kiss途徑在絕大多數脊椎物種中是高度保守的且已知其在人和小鼠中是 青春期的直接參與細胞生長調節（Seminara et al.，2003)。由于人或小鼠中Gpr54和 /或Kiss基因失活的不育已經通過異位GnRH施用而恢復。小鼠和人中的研究表明，失 活Gpr54有效地導致由于性腺機能減退而產生的兩性不育（d'Anglemont de Tassigny et al.，2007 ;de Roux et al.，2003)。Kiss_Gpr54系統在脊椎動物中是高度保守的 (Tena-Sempere et al.，2012)特別是在僅存在一個Kiss和Gpr54基因的哺乳動物中。然 而在魚中確定了多種不同的Kiss基因，在調查的所有物種中除了一個物種外受體Gpr54均 由一個基因編碼。帶有Gpr54突變的人和小鼠所表現出下丘腦GnRH的正常水平，這提示 Kiss/Gpr54信號負責釋放GnRH進入血流（Seminara et al.，2003)。這代表了通過直接將 GnRH或促性腺激素注射到Gpr54缺陷個體來繞過Kiss/Gpr54信號的機會。的確，Gpr54缺 陷的人對GnRH有反應（Seminara et al.，2003)，這表明青春期的下游信號組分保持完好無 損。
[0038] 在生殖生物學發表物中目前沒有魚親吻肽作用的直接證據。然而，kiss肽的施 用已經顯示出刺激垂體促性腺激素基因在性成熟的雌性斑馬魚（Kitahashi et al. 2008) 和石斑魚中表達，或刺激LH和FSH在歐洲鱸魚（Felip et al.，2008)和金魚中的分泌。 因此，理論上，可通過外源遞送親吻肽類似物（如親吻肽10)或促性腺激素類似物（LH或 FSH)拯救帶有GPR54和/或KiSS敲除的性未成熟和不育魚的生育。在該概念下，如果 施用正確的激素，確保生育的可逆地控制，可以繁育純合的kiss或kiss受體敲除的親魚 (knockout-broodstock)。該K0親魚的子代繼承了改變。這將提供經濟和環境益處。
[0039] 可通過一些方法失活性成熟選擇性的神經內分泌基因。基因的失活阻止由該基因 編碼的功能因子，如蛋白或RNA的表達。一種失活包括在編碼性成熟因子和/或啟動子和/ 或操縱子的序列中插入、缺失或取代一個或多個堿基，所述的性成熟因子和/或啟動子和/ 或操縱子在動物中因子的表達是必須的。失活可以是基因的敲除。基因可通過從動物基因 組中去除基因的至少一部分、改變基因以阻止由基因編碼的功能因子的表達、干擾RNA(由 動物的基因組或動物的多個細胞中的基因表達），或外源基因的顯性負調控因子的表達而 失活。
[0040]另一個可恢復的-不育*SSTac3/TacR3(Young，J.，Bouligand，J.，Francou，B. ,Raff in-Sanson, M. L. , Gaillez, S. , Jeanpierre, M. , Grynberg, M. , Kamenicky, P. , Chanson ,P. , Brailly-Tabard, S. , et al. (2010)。TAC3和TACR3缺陷導致人類中下丘腦先天性性 腺功能減退。J Clin Endocrinol Metab 95,2287-2295。對于 Kiss/Gpr54,對這些基因缺 陷的人表現出性腺機能減退，其通過脈動的（pulsatile)GnRH治療是可恢復的（Young et al.，2010)。可使用描述了的或本文參考了的方法失活Tac和/或Tac3。
[0041] 本發明的實施方式包括在選自由牛、羊、豬、雞、火雞、山羊、羊、魚、水牛、鴯鹋、兔、 有蹄類動物、鳥類、鼠類和家畜組成的組的動物中失活一種或多種選自由GnRHl、GPR54、 KiSSl、Tac和Tac3組成的組的基因。可在細胞和/或胚胎失活該基因和并且在動物中由 此產生。本文中描述了各種方法，如使用TALENs或鋅指核酸酶敲除細胞或胚胎中的基因， 和克隆和/或在代孕者中植入細胞/胚胎以制備建立者動物。
[0042]圖1描述了本發明的一種實施方式，在體外修飾牛細胞并用于克隆小牛。可飼養 小牛到適合屠宰的重量或使用因素處理小牛以允許其進入成熟期，所述因素為例如促性腺 激素類似物或直接提供敲除遺傳因子的因素。
[0043] 實施例1描述了用TALENs系統制造細胞改變的技術。實施例2描述了用于表1結 果的稀釋克隆（dilution cloning)技術。實施例3描述了突變檢測和RFLP分析技術。實 施例4(圖2)描述了將11個堿基對缺失基因滲入牛⑶F8外顯子3 (Belgium Blue突變）。 圖3描述了類似過程的結果，所述過程為將來自于一個物種的一個等位基因基因滲入另一 個物種。實施例5描述了使用寡HDR測試相同以及將等位基因基因滲入牛細胞。在實施例5 中，TALEN-誘導的同源重組消除了連鎖的選擇標記的需要。當單獨轉染時，bt⑶F8. 1TALEN 對在靶位點切割多達16%的染色體。共轉染攜超螺旋同源DNA修復帶有llbp缺失的模板， 其導致在期望的事件的未選擇下，于第3天0. 5到5%的基因轉換頻率（HDR)。在1. 4%的 經PCR篩選的分離克隆中鑒定了基因轉換，所述PCR是鑒定成功轉換的快速方法。實施例 6(圖4)描述了豬和牛成纖維細胞中4個目的位點的修飾。實施例7(圖5)顯示了對基因 八卩(：、〇)1^453465和^〇^8修飾的分析。實施例8(表1)顯示了10-64%(平均，45%) 目的插入缺失的恢復率，高達32%的克隆純合子用于修飾。實施例9(圖6)描述了克隆 豬，所述克隆豬是用修飾的在azoospermia-like (DAZL)中缺失的和修飾的大腸腺瘤息肉 (APC)基因生產的。實施例10 (圖7)描述了根據指定的基因靶向策略所制備的GPR54敲 除；實施例11詳述了生產具有GPR54敲除的修飾動物的方法。實施例12描述了使用定制 的CRISPR/Cas9核酸內切酶所生產的修飾。
[0044] 這些結果證實了修飾目的基因而無需連鎖的