微藻生物質蛋白質富集方法
【專利說明】微藻生物質蛋白質富集方法
[0001] 本發明涉及一種微藻生物質的蛋白質富集的方法，所述微藻更具體地是小球藻 屬（Chlorella)，甚至更具體地是耐熱性小球藻（Chlorella sorokiniana)或原殼小球藻 (Chlorella protothecoides)物種。
[0002] 藻類一大型藻和微藻一具有特殊但大多未經開發的豐富性。它們在食物、化學品 和生物能源生產中的應用仍極少。然而，它們隱藏著具有巨大價值的組分，只有以其為食的 海洋動物才能真正了解這些組分的豐富性和豐度。
[0003] 事實上，微藻是維生素、脂質、蛋白質、糖、色素和抗氧化劑的來源。
[0004] 因此，藻類和微藻受到使用它們來生產膳食補充劑、功能性食物、化妝品或藥物或 進行水產養殖的工業的關注。
[0005] 最重要的是，微藻是定殖于所有曝露于光的群落生境的光合微生物。
[0006] 在工業規模上，其單克隆培養是在光生物反應器（自養條件：具有光和C02)中進 行，或者對于一些微藻，也是在發酵罐（異養條件：在黑暗中在一種碳源存在下）中進行。
[0007] 事實上，少數微藻物種能在無光下生長：小球藻屬、菱形藻屬（Nitzschia)、小環 藻屬（Cyclotella)、四爿藻屬（Tetraselmis)、隱甲藻屬（Crypthecodinium)、裂壺藻屬 (Schizochytrium)〇
[0008] 此外，據估計在異養條件下培養的成本是在光養條件下培養成本的1/10,這是因 為對于技術人員來說，異養條件使得以下各項成為可能：
[0009] -使用與用于細菌和酵母的發酵罐相同并且容許控制所有培養參數的發酵罐。
[0010] -所產生生物質的量顯著大于基于光的培養所獲得的量。
[0011] 善用微藻一般需要控制發酵條件以積累所關注組分，例如：
[0012] -色素（葉綠素a、b和c、e-胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素、藻藍蛋白、黃葉素、藻紅 蛋白等），其需求因其顯著的抗氧化性質以及在食物中提供天然色彩而日益增加，
[0013] -蛋白質，以優化微藻的營養質量；或
[0014] -脂質，以優化微藻的脂肪酸含量（以其干物質重量計高達60%，甚至80% )，尤 其用于：
[0015] ?生物燃料應用，以及
[0016] ?人類或動物食物應用（當所選微藻產生所謂的"必需"（即，因人類或動物無法 天然產生而在膳食中提供）多不飽和脂肪酸或PUFA時）。
[0017] 因此，為獲得這種結果，充分研究了第一種高細胞密度（HCD)發酵方法，以獲得蛋 白質或脂質的最大產率和產量。
[0018] 這些HCD培養的目標是在最短時間內以盡可能最高的濃度獲得所需產物。
[0019] 例如，針對祖芬氏小球藻（Chlorella zofingiensis)的奸青素的生物合成來驗 證這個方案，其中證實這些微藻的生長與這種化合物的產生直接相關（王（Wang)和彭 (Peng)，2008,世界微生物學與生物技術雜志（World J Microbiol. Biotechnol.)，24 (9)， 1915-1922)。
[0020] 然而，維持其生長處于最大速率（y，以h 1計）的事實與所需產物的高產量并非 始終相關。
[0021] 事實上，業內專家很快就了解到，為了讓微藻產生大儲量的脂質，需要例如使這些 微藻經受限制其生長的營養壓力。
[0022] 現在，在發酵方法中解除了生長與產量的關系。
[0023] 例如，為促進多不飽和脂肪酸（本文中為二十二碳六烯酸或DHEA)的積累，專利申 請W0 01/54510建議解除細胞生長與多不飽和脂肪酸產生之間的關聯。
[0024] 因此，在微藻裂壺藻屬株系ATCC 20888中，在沒有氧限制下進行第一生長期，以 促進高細胞密度（大于l〇〇g/l)的產生；然后，在第二步驟中，供氧逐步減少，以對這些微藻 施加壓力，從而減慢其生長并起始所關注的脂肪酸的產生。
[0025] 在微藻寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii)中，以低葡萄糖濃度（約5g/l) 且因此具有低生長速率來獲得最高二十二碳六烯酸（DHEA，多不飽和脂肪酸）含量，（江 (Jiang)和陳（Chen)，2000,生物化學工藝（Process Biochem. )，35 (10)，1205-1209)。
[0026] 這些結果明確說明，產物形成的動力學可與微藻生長呈正相關或負相關，甚至呈 二者的組合。
[0027] 因此，在產物形成與高細胞生長無關的情形中，控制細胞生長速率是明智的。
[0028] -般來說，技術人員選擇通過控制發酵條件（Tp、pH等）或通過控制營養組分向發 酵培養基的供應（半連續，所謂的"分批給料"條件）來控制微藻生長。
[0029] 如果技術人員選擇在異養條件下借助碳源供應來控制微藻生長，那么他/她一般 選擇根據所產生的代謝物（例如，DHEA型多不飽和脂肪酸）調整給予微藻（寇氏隱甲藻、 纖細裸藻（Euglena gracilis)等）的碳源（純葡萄糖、乙酸鹽、乙醇等）。
[0030] 溫度也可以是一個關鍵參數：
[0031] _例如，已報道，某些微藻物種的多不飽和脂肪酸合成，例如極微小球藻 (Chlorella minutissima)的EPA合成，在低于所述微藻的最佳生長所需溫度的溫度下被 促進；
[0032] -相反，異養生長的原殼小球藻的葉黃素產率在生產溫度從24°C升高到35°C時較 尚。
[0033] 原殼小球藻無可非議地被公認為最佳產油微藻之一。
[0034] 在異養條件下，其將碳水化合物快速轉變為甘油三酯（大于其干物質的50%)。
[0035] 為了優化這種甘油三酯生產，技術人員通過作用于發酵培養基的營養環境來優化 朝向油產生的碳通量。
[0036] 由此得知，在供應足量碳，但在無氮條件下時，油積累。
[0037] 因此，此處C/N比率是決定性的，并且已確認，最佳結果是在不限制葡萄糖含量 時，直接作用于氮含量來獲得。
[0038] 不出所料，這種氮缺乏影響細胞生長，導致生長速率比正常微藻生長速率降低 3〇% (熊（Xiong)等人，植物生理學（Plant Physiology)，2〇10，154,第 1001-1011 頁）。
[0039] 為了解釋這個結果，熊等人在上文所提到的文章中顯示，事實上，如果將小球藻 生物質分為五種主要組分，也就是碳水化合物、脂質、蛋白質、DNA和RNA(占其干物質的 85% )，如果C/N比率對DNA、RNA和碳水化合物含量無影響，那么蛋白質和脂質含量變得突 出。
[0040] 因此，以低C/N比率生長的小球藻細胞含有25. 8 %的蛋白質和25. 23 %的脂質，而 高C/N比率使得能合成53. 8%的脂質和10. 5%的蛋白質。
[0041] 因此為了優化油產生，技術人員必須通過將碳通量轉向油產生來控制碳通量，以 降低蛋白質產生；在將這些微藻置于無氮培養基中時，該碳通量被重新分配并在脂質儲存 物質中積累。
[0042] 根據這個教導，為產生富含蛋白質的生物質，技術人員實施與此相反的代謝控制， 也就是應用代之以促進低C/N比率的發酵條件，并且因此：
[0043] ~-向發酵培養基供應大量氮源，同時使將轉化為蛋白質的碳源的載荷維持恒 定；并且
[0044] ~-刺激這些微藻生長。
[0045] 這就是將碳通量修改為朝向蛋白質產生（且因此朝向生物質產生），以減少儲存 脂質的產生。
[0046] 在本發明背景下，申請人公司選擇通過披露技術人員的傳統設想的一個替代性解 決方案來探索一條新路徑。
[0047] 因此，本發明涉及一種異養生長的微藻的蛋白質富集的方法，所述微藻屬于小球 藻屬，更具體地為耐熱性小球藻或原殼小球藻，所述異養培養方法包含旨在借助發酵培養 基中非氮營養源的缺乏來限制所述微藻生長的步驟。
[0048] 這個步驟是一個異養培養步驟，其中在培養基中以不足以容許微藻生長的量供應 非氮營養因子。應注意，"不足……的量"并不意味著不供應這種營養因子。這個營養缺乏 期的結果是減慢（限制）細胞代謝，但并非完全抑制代謝。
[0049] 在本發明的意圖中，"富集"是指生物質中的蛋白質含量增加至少15重量％，優選 地至少20重量％，使得該生物質中的蛋白質含量達到超過50重量％。
[0050] 更具體地，本發明涵蓋所述微藻的異養培養的方法，該方法包含旨在借助發酵培 養基中非氮營養源的缺乏來限制所述微藻生長