用于七種豬病病原鑒定的基因芯片及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物芯片領域。具體而言，本發明涉及一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿 菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和 豬傳染性胃腸炎病毒等7種病原鑒別檢測的芯片裝置。
【背景技術】
[0002] 豬支原體肺炎（Mycoplasmapneumoniaeofswine,MPS)、豬傳染性胸膜肺 炎（porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)、豬多發性衆膜炎與關節炎（Swine polyserositisandarthrithis)、豬圓環病毒相關疾病（porcinecircovirus associateddisease,PCVAD)、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveand respiratorysyndrome，PRRS)、豬痕（classicalswinefever,CSF)和豬傳染性 胃腸炎（transmissiblegastroenteritisofswine，TGE)分別是由豬肺炎支原體 (Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis,Hps)、豬圓環病毒（ porcinecircovirustype2,PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus,PRRSV)、豬 痕病毒（classicalswinefever virus,CSFV)和豬傳染性胃腸炎病毒（porcinetransmissiblegastroenteritis virus，TGEV)引起的一類急性、接觸性傳染病，廣泛存在于世界各地，嚴重影響我國養豬業 的發展。臨床上，七種病原的單一感染均會給養豬業造成極大的危害，而近年來常出現幾種 病原體混合感染或繼發感染的現象，不僅加大了對豬群的危害，而且增加了病原快速準確 檢測的難度。
[0003] 近年來，隨著全球一體化的加快，不斷擴大的國際貿易為動物疫病的擴散增加了 機會。傳統的病原分離鑒定和血清學方法，耗時長，需要專業的操作人員，已不能完全滿 足進出口動物疫病的快速、準確及高通量檢測。隨著分子生物學的發展，聚合酶鏈式反應 (PCR)廣泛應用于動物疫病的檢測，但目前尚無可同時檢測七種病原的檢測方法。此外， APP、HPS和Mhp的培養條件比較苛刻，不利于分離培養；TGEV、PRRSV和CSFV均為RNA病毒， RNA易降解、不穩定性一定程度上增加病原檢測的難度。基因芯片（Genechip)是由DNA或 寡核苷酸探針密集排列在經過共價結合醛基、氨基或多聚賴氨酸的固相支持物所形成的探 針陣列，在適當的溫度、濕度條件下，利用特異性探針與經過適當方式標記的待檢樣品DNA 通過堿基互補配對雜交，然后通過相應的檢測設備，檢測雜交信號的位置和強弱，判斷樣品 種類，完成疾病檢測和基礎研究等方面的工作。該方法具有高通量、平行化、微量化、自動 化、低成本的優點。結合基因芯片的優勢，建立一種快速檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、 副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬 傳染性胃腸炎病毒的基因芯片技術，可滿足進出口動物攜帶病原的快速、準確檢測，有效防 止動物疫病通過國際貿易擴散傳播。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是建立一種靈敏度高、特異性強、節時省力并且易于觀察結果的微 陣列芯片用于檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒 2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒。
[0005] 為了實現上述目的本發明采用的技術方案是：用于豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、 副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬 傳染性胃腸炎病毒七種病原檢測的基因芯片，包括：PCR反應混合液管、Taq聚合酶、PCR陽 性對照、PCR陰性對照、ddH20、檢測芯片、芯片探針的點樣分布、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌 檢測探針的核苷酸序列、副豬嗜血桿菌檢測探針的核苷酸序列、豬肺炎支原體檢測探針的 核苷酸序列、豬圓環病毒2型檢測探針的核苷酸序列、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測探針 的核苷酸序列、豬瘟病毒檢測探針的核苷酸序列、豬傳染性胃腸炎病毒檢測探針的核苷酸 序列、芯片蓋片、雜交液、雜交陽性對照、雜交盒。
[0006] 采用基因芯片微量點樣技術，將待測樣品探針與各種質控探針固定在經過化學修 飾的基片上，形成的微陣列。微陣列包括質控探針區和待測樣品探針區，其中所述質控探針 區內設置下述分區： 點樣位置質控分區P1，包含至少一個點樣位置質控探針，SEQIDN0. 8; 雜交陽性質控分區P2,包含至少一個雜交陽性質控探針，SEQIDNO. 9; 雜交陰性質控分區N，包含點樣緩沖液； 所述待測樣品探針區內設置下述至少一個待測樣品探針的分區： 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌探針分區；副豬嗜血桿菌探針分區；豬支原體肺炎探針分 區；豬圓環病毒2型探針分區；豬繁殖與呼吸綜合征病毒探針分區；豬瘟病毒探針分區； 豬傳染性胃腸炎病毒探針分區。
[0007] 各個探針序列如下： 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌探針：SEQIDNO. 1 ; 副豬嗜血桿菌探針：SEQIDNO. 2 ; 豬支原體肺炎探針：SEQIDNO. 3 ; 豬圓環病毒2型探針：SEQIDNO. 4 ; 豬繁殖與呼吸綜合征病毒探針：SEQIDNO. 5 ; 豬瘟病毒探針：SEQIDNO. 6 ; 豬傳染性胃腸炎病毒探針：SEQIDNO. 7。
[0008] 利用上述芯片檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬 圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的檢測方法，包 括如下步驟： (1) 待測樣品制備：按照商品化DNA/RNA提取試劑盒使用說明書提取待測樣品全基因 組DNA/RNA，制備待測樣品DNA/cDNA; (2) ?0?擴增：25 1^?0?反應液包含：^39酶12.5 1^、引物組1:3.11^、待測 樣品DNA/cDNA5yL、無核酸酶滅菌水4. 4uL; 其中，所述引物Mix含有： 序列為SEQIDN0. 10的10ymol/L豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 11的10ymol/L豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 12的10ymol/L副豬嗜血桿菌上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 13的10ymol/L副豬嗜血桿菌下游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 14的10ymol/L豬肺炎支原體上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 15的10ym〇l/L豬肺炎支原體下游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 16的10ymol/L豬圓環病毒2型上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 17的10ymol/L豬圓環病毒2型下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 18的10ymol/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒上游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 19的10ymol/L豬繁殖與呼吸綜合征病毒下游引物0. 1yL， 序列為SEQIDNO. 20的10ymol/L豬瘟病毒上游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 21的10ymol/L豬瘟病毒下游引物0. 05yL， 序列為SEQIDNO. 22的10ym〇l/L豬傳染性胃腸炎病毒上游引物0.lyL， 序列為SEQIDNO. 23的10ym〇l/L豬傳染性胃腸炎病毒下游引物0.lyL序列為SEQIDNO. 24的20ymol/L通用引物上游引物1yL， 序列為SEQIDNO. 25的20ymol/L通用引物下游引物lyL. 按如下步驟進行擴增：94°C5min;94°C30sec，56°C30sec，72°C25sec循環 12 次；94°C30sec，5(TC30sec，72°C25sec循環 30 次；72°C5min; (3) 雜交：首先配制雜交液，包括雜交緩沖液7.9yL、PCR擴增產物8yL、雜交陽性對 照0. 1yL，混勻后95°C變性8min，冰上放置5min，然后取其中15yL雜交液進行雜交； (4) 結果判讀：用微陣列芯片掃描儀掃描分析，去除陰性對照背景，與芯片雜交說明對 照，判定結果。
[0009] 本發明具有如下優點： (1)成功地構建了APP&HPS&Mhp&PCV2&PRRSV&CSFV&TGEV檢測基因芯片：本發明所制備 的基因芯片采用的各條篩選探針可與對應病原體目的基因進行特異性結合，雜交信號較強 且穩定。
[0010] (2)制備的檢測基因芯片具有良好的方法學特征：本發明建立了一種特異性好、靈 敏度高、穩定性強和節時省力的基因芯片檢測方法。
[0011] (3)檢測基因芯片的構建，為混合感染疾病的同步檢測和鑒別診斷提供快速、高效 的手段：為今后出入境動物檢疫和相應疫病控制提供了技術保障。對滿足進出境動物檢疫 工作的需要，控制豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環病毒2 型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的傳播，保障我國的畜牧業 安全、健康發展具有十分重要的意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1是芯片探針分布不意圖； 圖2是豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌雜交結果； 圖3是副豬嗜血桿菌雜交結果； 圖4是豬肺炎支原體雜交結果； 圖5是豬圓環病毒2型雜交結果； 圖6是豬繁殖與呼吸綜合征病毒雜交結果； 圖7是豬痕病毒雜父結果； 圖8是豬傳染性胃腸炎病毒雜交結果； 圖9是七種病原核酸雜交結果； 圖中：P1-點樣位置質控分區；P2-雜交陽性質控分區；N-雜交陰性質控分區；1-豬傳 染性胸膜肺炎放線桿菌探針分區；2-副豬嗜血桿菌探針分區；3-豬肺炎支原體探針分區； 4_