一種鑒別小反芻獸疫病毒疫苗株和基因4系野毒株的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及熒光RT-PCR檢測技術，具體地說，涉及一種能同時鑒別小反芻獸疫病 毒疫苗毒株和基因4系野毒株的熒光RT-PCR檢測技術。
【背景技術】
[0002] 小反會獸疫（Peste des petits ruminants, PPR)是由副黏病毒科、麻疹病毒屬的 小反會獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的一種高度接觸性傳染 病，是危害養羊業最重要的疫病之一。該病主要感染綿羊、山羊和野生小反芻動物。小反芻 獸疫主要在中非、西非、東非、中東和南亞等地區流行。我國于2007年首先發現該病，隨后 又有幾次小規模暴發，但只局限在西藏阿里地區。到了 2013年新疆再次暴發該病，并隨后 傳播到國內大多數省份，給我國的養羊業造成巨大損失。
[0003] 根據N基因的遺傳進化分析可以把小反芻獸疫病毒分為4個基因系，各種基因系 的分布呈現不同地域特征，其中以基因4系分布最為廣泛。亞洲地區的流行毒株絕大多數 為基因4系。目前國內流行的毒株均為基因4系，而國內和世界上廣泛使用的弱毒活疫苗 Nigeria75/1株為基因2系。
[0004] 由于小反芻獸疫的發病率和死亡率較高，為預防該病國內各省份普遍實行了采 用Nigeria75/1弱毒疫苗免疫的措施，并且加大了病原學監測力度。由于目前所使用的 Nigeria75/1疫苗是活毒疫苗，免疫動物后在一段時間內排出病毒，給該病的病原學監測 造成干擾。目前國家標準《小反芻獸疫診斷技術》中或世界動物衛生組織（0IE)的診斷手 冊中使用的方法均為針對所有小反芻獸疫病毒毒株的檢測方法，對病毒基因系的鑒別還需 要進一步測序分析，沒有區分疫苗毒株與流行毒株的高通量快速診斷方法。因此，實現小反 芻獸疫病毒弱毒疫苗株與野毒株的鑒別檢測，對于小反芻獸疫的防控工作具有重要的現實 意義。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題在于提供一種能在一個反應管中同時鑒別小反芻獸疫 病毒疫苗株和基因4系野毒株的一步法熒光RT-PCR檢測方法。
[0006] 本發明提供用于鑒別小反芻獸疫病毒疫苗株和基因4系野毒株的引物對，包括上 游引物PPRV-A1和下游引物PPRV-A2，其序列分別為ACCGGYATAG AGGTAACATG YAATCC和 CYTGGCTCCT AAGTmTTT ATAACA(SEQ IDN0:2);其中 Y 代表 T 或 C。
[0007] 本發明提供一種用于檢測小反芻獸疫病毒疫苗株核酸Real-time RT-PCR檢測的 TaqMan 探針 PPRV-L2P，其核苷酸序列 SEQIDNo.3 為：CAGGCCTCCG AGCCATCCCC TAG，或其反 向互補序列 SEQIDNo. 4:CTAGGGGATG GCTCGGAGGC CTG。
[0008] 本發明還提供一種用于檢測小反芻獸疫病毒基因4系野毒株核酸的TaqMan探針 PPRV-L4P，其核苷酸序列SEQIDNo.5為：CAGTCCCTTG AGTCGCCACC GAG，或其反向互補序列 SEQIDNo.6 為：CTCGGTGGCG ACTCAAGGGA CTG。
[0009] 用于檢測基因4系野毒株探針PPRV-L4P的5'端標記FAM熒光基團，用于檢測疫 苗株的探針PPRV-L2P端標記VIC熒光基團或HEX熒光基團。
[0010] 本發明還提供一種檢測小反芻獸疫病毒疫苗株和基因4系野毒株的Real-time RT-PCR檢測方法，是將上述引物組和探針加入到同一個反應管中進行檢測。
[0011] 本發明的小反芻獸疫病毒疫苗株和基因4系野毒株Real-timeRT-PCR檢測用引 物和TaqMan探針同時加入到一個反應管中；所用引物能擴增疫苗株和基因4系小反芻獸疫 病毒，疫苗株特異性TaqMan探針和基因4系特異性TaqMan探針分別標記不同的報告熒光 用以檢測不同毒株。在Real-timeRT-PCR檢測中，若在各自的熒光通道內產生與疫苗株或 基因4系相對應的特異性熒光曲線，則表示檢測出該報告熒光所對應的小反芻獸疫病毒毒 株。本發明能在Real-timeRT-PCR檢測中同時快速鑒別診斷小反芻獸疫病毒疫苗株和基 因4系野毒株，具有結果可靠、準確靈敏、操作簡單、成本低和節約時間等優點，特別適合在 小反芻獸疫病原學監測和疫情診斷中應用。
【附圖說明】
[0012] 圖1為同時檢測小反芻獸疫病毒疫苗株和野毒株Real-timeRT-PCR方法的特異 性試驗
[0013]圖2為小反芻獸疫病毒鑒別熒光RT-PCR方法對野毒株的敏感性試驗
[0014] 圖3鑒別熒光RT-PCR對臨床樣品的檢測結果。A為野毒株探針檢測結果，B為疫 苗株探針檢測結果。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行詳細說明。應當理解，本處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
[0016] 本發明通過對小反芻獸疫病毒基因組序列進行比對分析，選取了疫苗株與基因4 系野毒株的差異SNP位點區域進行引物和TaqMan探針的設計。用于檢測基因4系野毒株 探針PPRV-L4P的5'端標記FAM熒光基團，用于檢測疫苗株的探針PPRV-L2P5'端標記VIC 熒光基團或ffiX熒光基團，二種探針的3'端均標記BHQ1熒光淬滅基團。引物和探針序列 如下：
[0017]
[0018] 將上述引物、探針序列組合后建立檢測小反芻獸疫的疫苗株和野毒株的 Real-timeRT-PCR檢測方法。
[0019] 小反芻獸疫病毒疫苗株和野毒株Real-timeRT-PCR鑒別檢測方法采用以下步 驟：
[0020] (1)制備待測模板。采用Trizol核酸提取試劑或其它商品化試劑盒提取各種類型 待檢樣品中的病毒核酸。
[0021] (2)反應體系的配制。參照 Superscript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System說明書進行反應體系的配制，采用25yl反應體系。其中包括2XReaction Mix 12. 5 y 1，上游引物 PPRV-A1 (10 yM) 1 y 1，下游引物 PPRV-A2(10 yM) 1 y 1，探針 PPRV-L2P(10 yM)0.5 yl，探針 PPRV-L4P(10 yM)0.5 yl，Superscript IIII RT/Platinum Taq Mix 0? 5 y 1，ROX 0? 5 y 1，待測 RNA 模板 3 y 1，用無 RNase 的水足體積至 25 y 1。
[0022] (