一種檢測人類前列腺癌特異性基因的環介導等溫擴增試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種快速定性檢測人類前列腺癌特異性基因PCA3的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]前列腺癌(Prostate cancer，Pca)是常見的泌尿系惡性腫瘤，據美國腫瘤學會報道，Pca在美國的發病率已經超過肺癌成為第一位，死亡率也高居第2。隨著生活節奏的加快和飲食結構的西化，在我國及其他亞洲國家，Pca的發病率也在逐年升高，且發病年齡也趨于年輕化。早期診斷Pca可通過根治性切除術徹底治愈。因此，早期診斷對Pca的治療和患者的預后至關重要。
[0003]目前在臨床上仍根據前列腺特異性抗原(PSA)是否異常，指導前列腺穿刺活檢用來診斷Pca，具有一定的應用價值，但是血清PSA為前列腺特異性抗原，只具備組織特異性而不具備腫瘤特異性。前列腺增生、前列腺炎等良性病變也可使PSA表達升高，導致許多患者遭受了不必要的活檢，暴露出PSA在Pca診斷中的局限性。因此，探尋敏感性及特異性更加優越的Pca腫瘤標志物，對提高Pca的早期診斷有著十分重要的意義。
[0004]PCA3被認為是Pca的特異性基因，研究表明其在前列腺癌組織中高度表達，在正常前列腺組織或者前列腺增生組織中無表達或低表達，在其他腫瘤組織及器官中也無表達。但由于PCA3基因為非編碼基因，不表達為蛋白質，檢測起來有一定難度。目前用于檢測PCA3基因最常用的方法為核酸擴增技術(PCR)，雖然擴增結果穩定可靠，但檢測時程長，成本較高，操作繁瑣，不利于缺少技術設備的基層單位進行檢測。
[0005]環介導等溫擴增法(Loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)是一種新型的核酸擴增方法，它采用4條特異性引物及I條環引物識別靶基因，其可在等溫條件下I小時可將目的序列擴增10~9倍以上。LAMP反應會產生大量的焦磷酸根離子，它們與LAMP反應體系中的鎂離子(Mg2+)結合產生焦磷酸鎂沉淀，引起濁度變化，十分便于觀察，且整個擴增過程只需要一臺水浴鍋，大大加快了擴增進程并節省了實驗成本。如在LAMP反應體系中加入鈣黃綠素(一種熒光指示劑)，那么在反應結束后會產生黃綠色熒光。不僅如此，隨著LAMP技術的逐漸發展，實時濁度檢測儀器也于今年來問世，將配置好的LAMP反應體系置于濁度儀上進行反應可實時觀測濁度曲線，了解反應進程。
[0006]目前，公開的試劑盒反應體系不夠穩定，不利于檢測結果的快速獲取且假陽性結果較多，因此使得該試劑盒的商業使用受到了限制。
【發明內容】
[0007]本發明通過設計合適的引物并優化檢測條件，提供一種快速、定性檢測人類前列腺癌特異性基因PCA3的試劑盒。該試劑盒包括以下試劑:引物、2倍環介導等溫擴增反應緩沖液、陽性對照、陰性對照、DNA聚合酶、逆轉錄酶和顯色劑，所述的引物由一對外引物、一對內引物和一組環引物組成，所述的引物序列如下:
F3 (外引物):TGGATAITTAITTGAACGGGAT ；
B3 (外引物):AACGCACAGITTAGGCAG ；
LB (環引物):GGGAGGAGATAACCACGGG ；
FIP(內引物):AGCCATCAAGAITTTCTCGTCTGITITTGAAATGAAGTCACAAAGTGAG ;
BIP(內引物):TGCAACAAACAAAATGGAATACTGTAGAATCCTGACCCTCTGC。
[0008]上述各引物量濃度分別為:FIP/BIP40 μΜ、F3/B3 5 μ MaB 20 μ Mo
[0009]本發明所述的2倍環介導等溫擴增反應緩沖液(2XLAMP反應液)由40mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tr i s-HCL )、20mM氯化鉀(KCL )、16mM硫酸鎂(MgS04 )、20mM硫酸銨((NH4 )2S04) 1.6mM 甜菜堿(Betaine)、2.8mM 的 dNTPs 和 0.2% 質量百分濃度的吐溫 20(Tween20)組成。其中mM是摩爾濃度的單位，指的是每升溶液中所含有溶質的摩爾數。
[0010]本發明的所述陽性對照可以由以下方法制備得到:按常規的Trizol法由前列腺癌組織中提取RNA，逆轉錄成cDNA之后，PCR法擴增包含等溫擴增部分的一段序列，擴增結束經測序鑒定后，裝入T載體克隆后抽提質粒DNA，測定DNA濃度，然后調整濃度為每微升10~6拷貝作為陽性對照。
[0011]本發明所述的DNA聚合酶為具有鏈置換作用的BstDNA聚合酶，活力為8個活性單位/微升；所述逆轉錄酶采用鳥類成髓細胞白血病病毒逆轉錄酶，活力為10個活性單位/微升；所述的陽性對照為含人前列腺癌特異性基因PCA3的CDNA樣本；陰性對照為雙蒸水；所述顯色劑為鈣黃綠素螯合劑，所述鈣黃綠素螯合劑，為鈣黃綠素與Mg2+的螯合物，是一種熒光指示劑。LAMP反應的副產物焦磷酸離子與鎂離子結合釋放鈣黃綠素，發出黃綠色熒光。以上試劑均由上海生工生物技術公司提供。
本發明還提供一種檢測人類前列腺癌特異性基因PCA3的方法，具體包括以下步驟: Cl)常規方法提取組織、血液或尿液中的RNA ；
(2)配置擴增體系，每25ul擴增體系中，含有外引物Iul;內引物Iul，環引物lul，2倍環介導等溫擴增反應緩沖液12.5ul，BstDNA聚合酶0.9ul，鳥類成髓細胞白血病病毒逆轉錄酶0.1ul，步驟(I)中RNA提取液I?5ul (具體用量根據提取物來源不同，組織來源I?2ul，血液、尿液來源4?5ul)，其余為去離子水及鈣黃綠素顯色劑(如采用實時濁度分析儀可不加)；63°C恒溫反應I小時；
(3)反應結束后，可直接肉眼觀察，反應管內液體變為黃綠色說明檢測結果陽性；如采用實時濁度分析儀檢測可直接觀察反應擴增曲線，如有曲線記錄則為陽性。
[0012]本發明的工作原理是:LAMP反應分為三步，即:起初反應物模板的合成、循環擴增階段、延伸和再循環。環介導等溫擴增反應過程是先由外引物擴增出內引物擴增所需要的模板，即起始反應物模板的合成；緊接著由內引物引導合成靶基因DNA片段，由于內引物擴增的DNA片段含有該引物5’端DNA片段的反向互補序列，因而這些反向互補序列之間通過雜交形成莖環結構另外一條內引物與其互補鏈退火雜交后引導鏈置換合成反應，在擴增的DNA片段的另外一端產生了新的莖環結構，形成啞鈴狀結構，根據LAMP反應的反應原理，一般擴增反應均在I小時的擴增時間內達到平臺期，而如果反應開始的時間約晚就越容易造成一些中間產物相互反應，導致假陽性的產生，影響實驗的準確性。為此，我們在啞鈴狀結構的5’末端的環狀單鏈部分導入具有互補序列的環引物，可增加DNA合成的起點，可使反應開始的時間提升約20%，并在I小時該循環反應可使靶DNA累積到10~9拷貝，可通過熒光染料或實時濁度分析儀來觀察擴增結果。
[0013]與現有技術相比，本發明通過加入環引物顯著提升反應速率，平均反應開始時間為19.3min，而在之前的研究中未加入環引物平均反應開始時間為24.lmin。在實驗結果可靠性的比較中，加入環引物后假陽性結果明顯減少。與PCR技術相比，檢測時間減少約50%，在檢測成本方面也較PCR明顯減少。
【附圖說明】
[0014]圖1為自然燈光下各個樣本的LAMP結果。
[0015]圖2為各個樣本的實時濁度儀擴增曲線。
【具體實施方式】
[0016]下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0017]如圖所示。圖1中1~6號管為前列腺癌患者標本經LAMP反應后的情況，可直觀看出產生黃綠色熒光，而7~8號的良性前列腺增生患者無熒光產生。圖2中1~5號擴增區域為前列腺癌患者血樣，6~8號擴增區域為前列腺增生患者血樣，平均的反應開始時間提升約20%。一種檢測人類前列腺癌特異性基因的環介導等溫擴增試劑盒，包括:引物、2倍環介導等溫擴增反應緩沖液、陽性對照、陰性對照、DNA聚合酶、逆轉錄酶和顯色劑；所述的引物是根據DNA序列數據庫公布的人類PCA3基因序列設計的一對外引物、一對內引物及一組