一種以fmyyssr-3標記對煙草原料進行鑒定的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學研究領域，具體是一種以FMYYSSR-3標記（即分子標記技 術）對煙草原料進行鑒定的方法，由于本方法以煙草物種DNA的特異性作為鑒定依據，因此 與傳統鑒定方法相比，有更加客觀、更加準確、更加可靠的優勢。
【背景技術】
[0002] 在煙草原料的鑒別檢驗工作中，多是通過外觀判斷、評吸等手段進行煙草原料鑒 定，個別煙草原料鑒別檢驗涉及相關的化學成分檢測。但就目前來看，部分形態的煙草原料 (如煙絲、煙沫等)，很難從外觀上進行鑒別檢驗，煙草與其他植物之間、各煙草種類之間也 很難完全以化學成分檢測及評吸來進行鑒別；而且上述鑒別要求檢驗人員不僅需要掌握相 關的原料特性、化學成分分析方法、感官評吸技術，還需具備煙草原料生產和分級技能，檢 驗人員的培訓難度大；另外，煙草原料本身的霉變和不法分子所采取的染色、加香加料等手 段，也加大了檢驗人員進行準確鑒定的難度。
[0003] DNA分子標記技術屬于分子生物學研究范疇，是從DNA水平區分不同物種甚至是 同一物種不同個體之間的選擇性標記技術[1 7]。自上世紀80年代以來，隨著聚合酶鏈式 反應（PCR)技術的出現，DNA分子生物學研究發展迅猛，目前DNA分子標記技術已有數十 種之多，如限制性片段長度多態性標記（RestrictionFragmentLengthpolymorphism, RFLP)[8]、隨機擴增多態性標記（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAH))?、序列特異 性擴增區域標記（SequenceCharacterizedAmplifiedRegions,SCAR)[1°]、內含子長度多 態性標記（intron-lengthpolymorphism,ILP)[n]、單核苷酸多態性（SingleNucleotide Polymorphism，SNP)[12]、簡單序列重復標記（SimpleSequenceRepeats,SSR)[13]等。由于 在DNA分子水平，不同物種間甚至是同一物種不同個體之間都能得到很好的區分，因此DNA 分子標記技術作為物種分類鑒定的一種手段，已被廣泛地應用于屬間、種間、品種間的分類 鑒定和親緣關系研究中，幾乎可以對所有的生物種類進行分類鑒定 [14 24]，在目前物種鑒定 技術中發展最快，也最為熱門。表1列出了DNA分子標記技術在各類鑒定中的應用。
[0004] 表1DNA分子標記技術在各類鑒定中的應用
目前的煙草原料鑒別檢驗技術，以樣品的外觀、口感及化學成分特征為基礎，只能外 在、間接地反映煙草物種的特性，導致目前的鑒別檢驗易受外界環境、檢驗人員主觀感受 差異、加工條件及煙草本身器官組織變化等因素的影響，準確性、可靠性有較大局限；而以 DNA分子標記技術進行煙草原料鑒定，是以煙草基因組序列信息為基礎，可內在、直接地反 映煙草的特性，以其進行鑒別檢驗不受上述諸多因素的影響。因而以DNA分子標記技術來 對煙草原料進行鑒定，無疑將會更加準確、可靠。
[0005] 中國專利公開了云南紅云紅河集團申報的一種應用SSR分子標記技術鑒定商品 卷煙的方法，通過識別單品種或混合品種的特征條帶，掌握所鑒定樣品的原料品種組成，達 到辨別真偽的目的。
[0006] 隨著基因組學的迅速發展，越來越多的動植物基因組已經被測序出來。迄今為 止，在前科里，已有栽培番前（Solanum lycopersicum)，馬鈴薯（Solanum tuberosum)， 辣椒（Capsicum annuum)，本氏煙（Nicotiana benthamiana)，潘那利番前（Solanum pennellii)，野生酉昔栗番前（Solanum pimpinellifolium)，（Nicotiana tabacum)等的基因 組序列或基因組草圖被公布出來。這為我們開發煙草特異的分子標記提供了可能。作為面 向市場和應用、具有權威性和法律效應的鑒定技術，必須準確可靠，簡單易行。基于SSR的 分子標記，通過PCR擴增和凝膠電泳就可較為方便的完成樣品檢測。而其他基于SNP等的 分型手段，還必須經過sanger測序等一系列方式，增添不必要的成本和步驟。
[0007]
【發明內容】
[0008] 本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而提供的一種以FMYYSSR-3標記對煙 草原料進行鑒定的方法。
[0009] 本發明的研究過程及原理在于：廣泛收集了目前在煙草中已經開發和發表的SSR 標記，作為篩選和過濾的基礎。具體分析步驟包括：1、取擬南芥、本氏煙（國際上普遍采用 的一種模式煙草種，與普通煙草親緣關系較近）、栽培煙草、番茄和土豆作為參考序列，將候 選標記進行比對；2、過濾掉能和擬南芥、番前和土豆能比對上的SSR標記。3、選取能和本氏 煙、栽培煙草均能比對上，且擴增序列單一的SSR標記。4、篩選的標記掃描美國國立生物技 術信息中心（National Center for Biotechnology Information NCBI)數據庫的所有物種 基因序列信息，驗證上述引物在煙草中的特異性。經過篩選，最終確定以FMYYSSR-3標記， 對樣品是否為煙草進行鑒定。
[0010] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的： 一種以FMYYSSR-3標記對煙草原料進行鑒定的方法，在以十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)法，對各個品種標準煙草樣品的DNA進行提取后，以所設計的引物對其進行PCR擴 增，在經過電泳分析后，確定煙草物種的特異性條帶位置；再以同樣的方法對樣品進行處理 后，視其在相應位置有無條帶產生來判斷該樣品是否為煙草，具體步驟如下： 1) FMYYSSR-3標記的引物設計，上下游引物序列分別為CTGAATGCAGACAATCGGAC和 TTAAGTACACCGGTCGAGGG ； 2) 煙草樣品及待測樣品DNA提取：（1)取不同樣品分別將其組織碾磨成細粉末，放入2 mL離心管中。（2)加入600~800 yL的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65°C水浴預熱)，每 3~5 min輕輕震蕩幾次，20 min后12000 r/min離心10~15 min。（3)小心吸取上清液，加 入等體積的苯酸：氯仿(各400 yL)溶液，混勾，4 °C，12000 r/min，離心10~15 min;(4)小 心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勾，4 °C，12000 r/min，離心10~15 min，重復2~3次， 以蛋白層不出現為止。（5)取上清，-20 °C沉淀1~2 h，4 °C，12000 r/min，離心10~15 min; (6)棄去上清液，用50%~70%乙醇洗滌沉淀2次；室溫下干燥后（一般干燥10~15 min)， 于-20 °C或者-70 °C下保存備用。
[0011] 3) PCR反應按以下程序進行：解鏈溫度95°C，30秒，退火溫度55°C，30秒，延伸溫 度68 °C，30秒，重復35個循環。
[0012] 4)取25 y L的PCR產物凝膠電泳分析，在確定煙草物種的特異性條帶位置后，視 樣品在相應位置有無條帶產生來判斷該樣品是否為煙草。結果如圖1所示。從電泳結果可 以看出，所有煙草樣品均能擴出明顯的特異性條帶(約200 bp處)，該條帶在樣品1-4中均 能擴出，在樣品5-8中均未見擴出。這說明樣品1-4為煙草，樣品5-8為非煙草。
[0013] 本發明相比現有技術的優點在于：本方法以煙草物種DNA的特異性作為鑒定依 據，因此與傳統鑒定方法相比，有更加客觀、更加準確、更加可靠的優點。
[0014] 本發明與云南紅河集團所申報專利的具體區別體現在以下幾點： 1.本發明的SSR標記在設計時經過了嚴謹的生物信息學分析，針對煙草物種的特異位 點進行引物設計，這與云南的專利申報內容有著本質區別。
[0015] 2.本發明所設計的引物與云南專利所設計的引物序列不同。我們引物設計的出 發點，是為了滿足煙草原料鑒別檢驗工作的需求，具體來說，我們設計的引物是為了鑒定待 測樣品是否為煙草樣品，這與云南專利的用途方面有著顯著差異。
[0016] 3.本發明設計的SSR標記與云南專利的SSR標記用途不同：云南專利所設計的 SSR標記用于商品卷煙的真假判定；我們所設計的SSR標記用于煙草與非煙草樣品的判定， 這在涉案煙草原料的處理中非常重要。
【附圖說明】
[0017] 圖1.煙草鑒定DNA分子標記FMYYSSR-3的擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果， 圖中：1. K326 ;2.云煙97 ;3.林煙草；4.絨毛狀煙草；5.樣品1 ;6.樣品2 ;7.樣品 3;8?樣品 4;9?樣品 5;10?樣品 6;11?樣品 7;12?樣品 8. M，trans2KDNAmarker〇
【具體實施方式】
[0018] 本發明以下結合實施例做進一步描述： 實施例1 1. FMYYSSR-3標記的引物設計。上下游引物序列分別為CTGAATGCAGACAATCGGAC和 TTAAGTACACCGGTCGAGGG 〇
[0019] 2.煙草樣品及待測樣品DNA提取：⑴取不同樣品分別將其組織碾磨成細粉末， 放入2 mL離心管中。（2)加入600 yL的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65°C水浴預熱)， 每3 min輕輕震蕩幾次，20 min后12000 r/min離心10 min。（3)小心吸取上清液，加入等 體積的酚：氯仿(各400 yL)溶液，混勻，4 °C，12000 r/min，離心10 min; (4)小心吸取上 清液，加入等體積的氯仿，混勾，4 °C，12000 r/min，離心10 min，重復2次，以蛋白層不出現 為止。（5)取上清，-20 °C沉淀1 h，4 °C，12000 r/min，離心10 min; (6)棄去上清液，用 50%乙醇洗滌沉