一種利用畢赤酵母表達系統生產云芝免疫調節蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥，特別是一種利用畢赤酵母表達系統生產云芝免疫調節蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]真菌免疫調節蛋白(fungal immunomodulatory proteins，FIPs)是從食藥用真菌菌體中發現的一種新型生物活性小分子蛋白質。該蛋白的發現，打破了傳統上人們認為“真菌多糖是食藥用真菌主效活性成分”的觀點，激發了人們從食藥用真菌中尋找新型活性成分的興趣。目前從食藥用真菌中獲得了 8種真菌免疫調節蛋白:LZ-8、FlP-fve、FIP-vvo,FIP-gts、FIP-gm1、FIP-gja、FlP-gsi 和 FlP-tvc，分別來自靈芝 Gandenmlucidim、松杉靈_芝小抱子靈芝(?.microsporum、U_m G.japnoicum、繁芝 G.sinense、各與\裔 Flaimulinavelutipes、卑裔 Volvariellavolvacea^-W7X2! Trametes versicolor,它們組成了一個新的蛋白質家族。FIPs成員間具有相似氨基酸序列和結構，由110-114個氨基酸組成，具有較高的同源性，達60-100%，有47個氨基酸完全一致，并有4處保守區域，與行使功能有直接關系，顯示了真菌免疫調節蛋白在分子進化上的保守性。
[0003]不同來源的真菌免疫調節蛋白之間有相似的免疫學功能，例如能夠凝集紅細胞，促進淋巴細胞增殖，抑制機體多種過敏性反應，降低抗體產生，降低小鼠足墊水腫和移植組織的排斥反應，并促進T淋巴細胞分泌多種細胞因子(白介素-2、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ等)。另外，真菌免疫調節蛋白具有抗腫瘤活性，對肺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤細胞具有抑制生長或者直接殺傷作用，并且無毒副作用。因此真菌免疫調節蛋白是一種極具開發成免疫調節藥物潛力的蛋白質，可以用于腫瘤和免疫系統疾病的治療。
[0004]云芝免疫調節蛋白FlP-tvc是從中國傳統藥用真菌云芝(7: versicolor)發現的一種真菌免疫調節蛋白。FlP-tvc由111個氨基酸殘基組成，分子量為12440Da，等電點/λ[為4.81，不含組氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸(Li et al.2012，Pro ExpPurif, 82:339-344)。FlP-tvc能夠凝集紅細胞；是一種有絲分裂原，具有促進小鼠脾淋巴細胞增殖的作用；能夠誘導淋巴細胞分泌白介素IL-2、干擾素IFN-γ、腫瘤壞死因子TNF-α等細胞因子；同時具有抑制肺癌、肝癌等腫瘤細胞生長的生物活性。因此，FlP-tvc是一種極具開發潛力的藥用蛋白質。
[0005]從云芝子實體中提取天然免疫調節蛋白的產率很低，約為3mg/kg干重，因此應用基因工程將FlP-tvc基因轉入到相應的宿主中表達獲得大量重組蛋白，從而進行開發應用是非常有價值和前景的。Li等(2012，Pro ExpPurif, 82: 339-344)報道FlP-tvc在大腸桿菌BL21 (DE3)中的重組表達，但僅有20%的可溶性重組蛋白，大部分以包涵體的形式存在。盡管原核生物細菌表達具有簡單快速的特點，但是由于對目的蛋白形成大量的包涵體，并且蛋白質的高級修飾不完善、生物學活性低于天然蛋白等缺點而不適于大規模工業化生產。
[0006]畢赤酵母表達系統是迄今為止最為成功的高效表達系統，其遺傳背景相對清楚，外源基因可穩定遺傳，表達產量高，成本低，特別適合表達小分子活性蛋白。另外，作為真核表達系統，畢赤酵母具有類似其他動植物細胞的翻譯后修飾功能，如蛋白質折疊、糖基化和磷酸化等。由于畢赤酵母表達系統兼有原核和真核表達系統的優點，在基因工程領域中得到日益廣泛的應用，同時考慮云芝免疫調節蛋白FlP-tvc的特點和其他表達系統的不足，用該系統表達云芝免疫調節蛋白FlP-tvc可以作為一種理想的選擇和途徑。但至今還未見云芝免疫調節蛋白FlP-tvc在畢赤酵母中成功表達進行大量生產的報道。
【發明內容】
[0007]針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種利用畢赤酵母表達系統生產云芝免疫調節蛋白的方法，可有效解決云芝免疫調節蛋白的制備問題。
[0008]本發明解決的技術方案是，包括以下步驟:
(1)按照畢赤酵母密碼子偏好性合成云芝免疫調節蛋白FlP-tvc基因的核苷酸序列SEQ ID N0.1 ；
所述的畢赤酵母為畢赤酵母菌細胞GS115 ；
(2)利用限制性內切酶酶切步驟(I)中合成的云芝免疫調節蛋白FlP-tvc與表達質粒載體X，構建重組表達質粒X-FIP-tvc，方法是，將合成的基因序列與質粒載體Z利用限制性內切酶進行酶切，回收目的片段，利用T4 DNA連接酶將的酶切片段與質粒載體i酶切片段連接，得到重組表達質粒X-FIP-tvc,轉化到大腸桿菌DH5 α中進行擴增；
所述的表達質粒載體X為組成型表達質粒載體pGAPZ a A或誘導型表達質粒載體pPICZa A ；
(3)利用限制性內切酶對重組表達質粒載體X-FIP-tvc進行線性化后轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，應用含抗生素的平板和PCR方法篩選出組成型陽性轉化子或誘導型陽性轉化子；
(4)表達重組蛋白rFIP-tvc畢赤酵母菌株的發酵篩選:從步驟(3)發酵篩選出的組成型陽性轉化子在YPD液體培養基中培養3-5d后，發酵上清液以SDS-PAGE檢測蛋白質表達量，篩選出組成型分泌表達rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株；或從步驟(3)篩選出的誘導型陽性轉化子在BMSY培養基中培養2-4d，菌液加入甲醇進行重組蛋白的誘導表達，誘導3-7d，發酵上清液以SDS-PAGE檢測蛋白質表達量，篩選出誘導型高水平分泌表達rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株；
(5)畢赤酵母重組菌株發酵上清液中分離純化云芝免疫調節蛋白FlP-tvc，將步驟(4)篩選出的rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株進行發酵培養或誘導表達3-7d，發酵上清液用硫酸銨進行沉淀，沉淀用平衡緩沖液進行溶解并用平衡緩沖液進行透析24-48h，將透析后的蛋白樣品上平衡緩沖液透析后的N1-NTA層析柱進行親和交換層析，獲得純化的重組蛋白rFIP-tvc,以真空冷凍干燥或噴霧干燥等方法制得云芝免疫調節蛋白FlP-tvc固體粉末。
[0009]本發明成本低、周期短、技術上容易，適于工業化生產，純度高。
【附圖說明】
[0010]圖1為本發明構建的表達重組云芝免疫調節蛋白rFIP-tvc組成型質粒表達載體pGAPZ a A-FIP-tvc 的示意圖。
[0011]圖2為本發明構建的表達重組云芝免疫調節蛋白rFIP-tvc誘導型質粒表達載體pPICZ a A-FIP-tvc 的示意圖。
【具體實施方式】
[0012]以下結合附圖和具體情況對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0013]本發明在具體實施中，包括以下步驟:
(1)按照畢赤酵母密碼子偏好性合成云芝免疫調節蛋白FlP-tvc基因的核苷酸序列SEQ ID N0.1 (已在《Li et al.2012，Pro ExpPurif,82: 339-344》中公開)；
所述的畢赤酵母為畢赤酵母菌細胞GS115 (市售產品，如ACCC中國農業微生物菌種保藏管理中心、ISF中國農業科學院土壤肥料研究所或CGMCC普通微生物菌種保藏管理中心保藏的菌株)；
(2)利用限制性內切酶酶切步驟(I)中合成的云芝免疫調節蛋白FlP-tvc與表達質粒載體X，構建重組表達質粒X-FIP-tvc，方法是，將合成的基因序列與質粒載體Z利用限制性內切酶進行酶切，回收目的片段，利用T4 DNA連接酶將的酶切片段與質粒載體i酶切片段連接，得到重組表達質粒X-FIP-tvc,轉化到大腸桿菌DH5 α中進行擴增；
所述的表達質粒載體X為組成型表達質粒載體pGAPZ a A或誘導型表達質粒載體pPICZα A ；
(3)利用限制性內切酶對重組表達質粒載體X-FIP-tvc進行線性化后轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，應用含抗生素的平板和PCR方法篩選出組成型陽性轉化子或誘導型陽性轉化子；
(4)表達重組蛋白rFIP-tvc畢赤酵母菌株的發酵篩選:從步驟(3)發酵篩選出的組成型陽性轉化子在YPD液體培養基中培養3-5d后，發酵上清液以SDS-PAGE檢測蛋白質表達量，篩選出組成型分泌表達rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株；或從步驟(3)篩選出的誘導型陽性轉化子在BMSY培養基中培養2-4d，菌液加入甲醇進行重組蛋白的誘導表達，誘導3-7d，發酵上清液以SDS-PAGE檢測蛋白質表達量，篩選出誘導型高水平分泌表達rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株；
(5)畢赤酵母重組菌株發酵上清液中分離純化云芝免疫調節蛋白FlP-tvc，將步驟(4)篩選出的rFIP-tvc的畢赤酵母重組菌株進行發酵培養或誘導表達3-7d，發酵上清液用硫酸銨進行沉淀，沉淀用平衡緩沖液進行溶解并用平衡緩沖液進行透析24-48h，將透析后的蛋白樣品上平衡緩沖液透析后的N1-NTA層析柱進行親和交換層析，獲得純化的重組蛋白rFIP-tvc,以真空冷凍干燥或噴霧干燥等方法制得云芝免疫調節蛋白FlP-tvc固體粉末。
[0014]步驟(I)中所述的按照畢赤酵母密碼子偏好性合成云芝免疫調節蛋白