不含有信號肽的在馬克斯克魯維酵母營養缺陷型菌株中進行外源基因表達的重組載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種在營養缺陷型菌株中使用的重組表達載體，尤其涉及一種不含有 信號肽的重組表達載體。
【背景技術】
[0002] 酵母是單細胞的真核生物，它兼具微生物的特性和真核生物的蛋白合成加工系 統。因此，它被廣泛的用于表達多種外源真核蛋白。目前主流的酵母表達系統包括畢赤酵 母和釀酒酵母表達系統。但是，畢赤酵母的蛋白表達需要用甲醇誘導，不適合用于食用蛋白 的生產。釀酒酵母易產乙醇，生長密度低，表達水平偏低。針對這一系列問題，發展新型的 安全性高和產量高的酵母表達系統具有很高的工業價值。
[0003] 馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus)已經通過了美國和歐洲的GRAS 和QPS安全認證，其自身不僅被認為是安全的微生物菌株，同時也被認為是可用于制備食 品級重組蛋白（酶）的安全微生物菌株，是一種被歐盟認可的食品級的酵母。它具有營養 要求極其簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應范圍廣等特點。同時，它還具有高效分泌 蛋白的特點。因此，馬克思克魯維酵母具有高效表達食用和飼用蛋白的巨大潛力。
[0004] 表達系統由宿主菌和表達載體構成。對于食品安全級別的酵母表達系統，宿主菌 通常選用營養缺陷型標記。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一種在營養缺陷型菌株中進行外源基因表達的重組載體。
[0006] 本發明第一個方面是提供一種不含有信號肽的在馬克斯克魯維酵母營養缺陷型 菌株中進行外源基因表達的重組載體，按照順序包括氨芐抗性基因、PKD1載體、菊粉酶啟動 子、多克隆位點、菊粉酶終止子、營養基因啟動子、營養基因開放閱讀框（0RF)。
[0007] 其中，所述營養基因優選為馬克斯克魯維菌株的營養基因，如URA3基因、HIS3基 因、ADE2基因中的任意一種或幾種，更優選為URA3基因。
[0008] 其中，所述多克隆位點可以是包括一個或多個位點限制性酶切位點的序列，所述 限制性酶切位點如SmaI、XmaI、SpeI、NotI中的任意一種或幾種，更優選為SpeI、NotI、以及 Smal和/或Xmal中的任意一種或幾種，如Smal/Xmal、Spel、Notl。
[0009] 其中，所述多克隆位點長度優選為15_25bp，更優選為18_23bp，更優選為 19-21bp〇
[0010] 在本發明的一種優選實施例中，所述重組載體的DNA序列如SEQIDNo. 1所示。
[0011] 本發明第二個方面是提供一種構建上述重組載體的方法包括：
[0012] 擴增pUC19質粒、PKD1載體，獲得pUC19與PKD1連接的片段I ;
[0013] 擴增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含營養基因啟動子或0RF的片段II;
[0014] 擴增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含菊粉酶基因啟動子、菊粉酶信號肽、和部 分多克隆位點的片段III;
[0015] 擴增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含菊粉酶終止子和部分多克隆位點的片段 IV，
[0016] 將片段I、II、III、IV進行連接，獲得第一重組載體。
[0017] 使用定點突變試劑盒，對所述第一重組載體進行突變，獲得所述不含信號肽的重 組載體。
[0018] 其中，所述定點突變試劑盒優選為QuikChangeII試劑盒。
[0019] 其中，所述突變所用引物優選為：
[0020] 5 '-ATAAGTGACACATTTAATTTTTTTTTTGTTAGATACTAGTCCCGGGGCGGCCGCTTAAGGCCGCAA GCTT-3' ；
[0021] 5 ?-AAGCTTGCGGCCTTAAGCGGCCGCCCCGGGACTAGTATCTAACAAAAAAA AAATTAAATGTGTCACTTAT-3'。
[0022] 其中，擴增pUC19質粒的引物優選為：
[0023] 正向引物：
[0024]5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'；
[0025] 反向引物：
[0026] 5'-TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3' 。
[0027] 其中，擴增PKD1質粒的引物優選為：
[0028] 正向引物：
[0029] 5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3' ；
[0030] 反向引物：
[0031] 5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3' 。
[0032] 其中，在一種優選實施例中，獲得pUC19與PKD1連接的片段I方法如下：擴增 PUC19質粒得到A片段，擴增Gateway系統載體的pcYGW獲得B片段，擴增PKD1載體獲得 C片段，將A、B和C片段連接，將連接得到的質粒進行擴增，得到包括pUC19與PKD1的片段 1〇
[0033] 其中，擴增pcYGW所用引物優選為：
[0034] 正向引物：5'-GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3' ；
[0035] 反向引物：5' -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'。
[0036] 其中，擴增質粒的引物優選為：
[0037] 正向引物：5'-GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3' ；
[0038] 反向引物：
[0039] 5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3' 。
[0040] 其中，擴增獲得片段II的引物優選為：
[0041] 正向引物：5'-CTAGGATCGGTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATT-3' ；
[0042] 反向引物：5' -GTACCCCTCTTAAGCGGATCTGCCTACTCTCTTCA-3'。
[0043] 其中，擴增獲得片段III的引物優選為：
[0044] 正向引物：5'-GCATGCCGATCCGAAAAGGTAAACAGACACAAAAAC-3' ；
[0045] 反向引物：
[0046] 5'-GTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATCACTGAAG-3' 。
[0047] 其中，擴增獲得片段IV的引物優選為：
[0048] 正向引物：
[0049] 5'-ACGGTGACCCCGGGACTAGTGCGGCCGCTTAAGGCCGCAAGCTTTGATCTG-3' ；
[0050] 反向引物：5' -CAGAATTCGACCGATCCTAGAATGTTGGTCAGATGTG-3'。
[0051] 本發明第三個方面是提供一種轉化子，將外源基因插入到所述重組載體的多克隆 位點中，獲得含有外源基因的質粒，將所述質粒轉入營養基因缺陷型菌株中，獲得所述轉化 子。
[0052] 其中，所述營養基因缺陷型菌株優選為營養基因缺陷型馬克斯克魯維菌株。
[0053] 所述營養基因缺陷優選為包括URA3基因、HIS3基因、ADE2基因缺陷中的任意一種 或幾種，更優選為URA3基因缺陷。
[0054] 本發明構建的不含有信號肽的重組載體，可用于構建轉化子，來實現外源基因的 表達。
【附圖說明】
[0055] 圖1為本發明實施例中所構建重組載體原理圖；
【具體實施方式】
[0056] 步驟1，擴增pUC19質粒
[0057] 正向引物：
[0058] 5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'
[0059] 反向引物：5' -TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'
[0060] 利用所述引物擴增pUC19質粒。PCR擴增反應按照Vazyme公司的PhantaSuper FidelityDNAPolymerase的使用說明書進行，退火溫度為58°C，延伸時間為3分鐘，30個 循環。PCR產物命名為A片段。
[0061] 步驟2,擴增Gateway系統載體的pcYGW
[0062] 正向引物：5, -GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3，
[0063] 反向引物：5, -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'
[0064] 利用所述引物擴增Gateway系統載體的pcYGW。PCR擴增條件同步驟1，除了延伸 時間為1分鐘。PCR產物命名為B片段。
[0065] 步驟3，擴增PKD1載體
[0066] 正向引物：5' -CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3' 反向引物：