一種三順反子肌肉特異雙向共表達基因轉移體及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域中的基因工程技術領域，涉及一種三順反子肌肉特異雙 向共表達基因轉移體及制備方法
【背景技術】
[0002] 在轉基因動物中外源基因的高效表達必須依賴好的表達載體。更需要多基因，組 織特異性共表達的載體。
[0003] MSTN，又稱肌肉生長抑制素，屬于轉化生長因子超家族成員，1997年 McPherron、Lawler首次制備了 MSTN基因敲除小鼠[1]，證實它最重要的功能即對骨骼肌的 生長與發育負調控骨骼肌生長。MSTN作為一種分泌型蛋白主要由骨骼肌產生，在不同物種 中MSTN基因都由3個外顯子（exonl/2/3)和2個內含子（intronl/2)組成，在哺乳動物中 MSTN的成熟肽序列同源性很高，例如人和牛的相似度為98. 2%。自然突變或者通過基因 操作手段制備的MSTN功能缺失型的動物（如小鼠、牛、羊等）表現出骨骼肌肥大的雙肌效 應，是一種常染色體隱性遺傳的性狀 [2 3]，因此在家畜育種中如何有效阻斷或抑制MSTN的 表達，如何使MSTN失活成為家畜育種的研究熱點。在醫學方面抑制MSTN能夠增強橫紋肌 生長，治療肌肉萎縮，減少肥胖，改善心臟收縮性，因此，更多抑制MSTN表達的基因操作方 法在不斷的發現和研究中。
[0004] 核基質結合區（MARS)是真核生物染色質中與核基質或核骨架特異結合的一段 DNA序列。MARs參與DNA復制調控和轉錄調控等多種核生化過程。
[0005] MARs的長度一般為300 - lOOObp，也有的長達幾個kb，維持其活性的最小長度約 是300bp，MARs是非編碼序列，AT含量高達70 %，不同的MARs序列不同，但往往含有相似的 結構基元，如煙草中發現TM2序列具備一般MARs序列的基本特征：其序列全長lOOlbp，AT 含量為62.8%，序列上含有一個典型的1'-13(?，兩個潛在的0嫩解旋序列仏4141'1')和一個 潛在的拓撲異構酶II結合位點（CTTTATATTGTTGAC)。
[0006] 研究表明，MARs序列的功能包括邊界因子（boundarye lement)作用、染色質調節 作用、DNA復制起始子的組分、染色體結構組成作用、MARS對轉基因表達的調控作用，鑒于 MARs與基因表達間的關系，尤其它能顯著地增強轉基因表達、克服位置效應、消除轉基因沉 默，它已被作為一種順式調控元件應用到轉基因技術中。
[0007] MRF4,肌肉特異啟動子，真核生物啟動子位于基因5'端上游轉錄起始位點附近，是 包含核心啟動子以及上游轉錄調控元件的一段DNA序列，這些轉錄調控元件控制著基因表 達的強度和特異性。肌肉特異性啟動子的上游調控元件種類、數量和排列順序決定著基因 在肌肉中的特異性表達。目前，人們分離了許多肌肉特異性啟動子，如骨骼肌a- actin、心 肌a -actin、肌肉肌酸激酶（MCK)、肌球蛋白重鏈（MyHC)、結蛋白（desmin)和生肌調控因子 家族（MyoD、Myf5、Mrf4和Myogenin)等肌肉特異性基因的啟動子，并對這些啟動子的轉錄 活性和其對肌肉細胞的增殖、分化作用進行深入研究]。本MRF4是根據"肌肉特組織特異 性啟動子生物信息學設計路線"最終優化的MRF4序列，在兩端添加Kpnl和Smal酶切位點 及保護堿基，將序列送至takara公司，進行人工合成。
[0008] FAD3是在植物中發現的一種脂肪酸去飽和酶基因，催化細胞中亞油酸到亞麻酸的 反應，研究表明在非光合作用的組織中，FAD3蛋白主要為co-3去飽和酶的功能，催化組織 中約80%三稀脂肪酸的合成。〇_3多不飽和脂肪酸（〇_3polyunsaturated fatty acids， PUFA)是組成人體必需的物質，對健康非常重要，《-6與0-3PUFA比值過高可導致心血管 疾病、癌癥、炎癥以及自身免疫反應等疑難病。但由于哺乳動物體內缺乏《_3脂肪酸去飽 和酶，自身不能催化合成《-3PUFA，只能通過飲食獲得。
[0009] RNAi技術，用基因打靶技術敲除MSTN基因，已在多種模式動物中成功運用，但該 技術需要消耗大量的時間和資源而且往往效率很低。由于RNAi轉基因小鼠的出現，使在哺 乳動物個體水平上研究靶基因的敲減成為了可能。RNAi技術的優越性：①RNAi效應可以遺 傳。②dsRNA的表達受到特異性啟動子的調控，因而可以有目的地在特定時相內啟動RNAi。 避免基因突變或敲減進行可遺傳的修飾時，會過早的沉默基因，從而產生致死表型，使得無 法進一步研究，從這點來看RNAi比基因敲除具有優越性。另外，利用RNAi可以很快得到許 多有關基因的功能信息，而且可以達到研究信號通路中多個基因的目的。有研究證明，大于 50bp的外源雙鏈RNA轉染細胞后，會引起干擾素途徑，但轉染19-23bp的shRNA卻可以避免 干擾素途徑，從而特異性降解靶基因，而且這種shRNA具有高效、穩定的特點。
[0010] IRES序列，內部核糖體進入位點序列，真核生物大多數蛋白質合成采用了依賴帽 子結構的翻譯起始方式.但一組缺乏帽子結構的RNA病毒的蛋白質合成起始是依賴其5' 端非翻譯區（untranslated region，UTR)，即內部核糖體進入位點（IRES)，該位點是一段高 度保守序列，可使其前后基因在同一啟動子下轉錄一個雙順反子mRNA，而轉譯時使兩基因 分別翻譯成兩個獨立的產物。因此，在真核生物轉基因表達載體構建中，常用于構建在一個 啟動子下IRES連接兩個基因編碼序列，實現雙順反子共表達。
[0011] DsRed2基因，紅色熒光蛋白基因，常用于轉基因的標志性基因。
[0012] 目前，構建真核表達載體多為非組織特異、單順反子或雙順反子表達載體。而生物 改造，尤其經濟形狀、數量性狀的改造往往涉及多個基因，因此，多基因共表達的真核載體 的構建，至關重要。多基因單向共表達，往往產生相互影響。而非組織特異性啟動子在所有 組織中均表達，并非需要，有時是有害的。
【發明內容】
[0013] 為解決上述問題，本發明提供了一種三順反子肌肉特異雙向共表達基因轉移體及 制備方法，能使三種目的基因雙向高效組織特異共表達，無質粒載體主干序列、無抗性選擇 基因，潔凈且安全的三順反子共表達基因轉移體。
[0014] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：
[0015] 三順反子肌肉特異雙向共表達基因轉移體，其特征在于，基因轉移體包括MARs 牛核基質結合區、以牛肌肉抑素（MSTN)第三號外顯子（926-947位點）為靶點的小發夾 RNA(shRNA)、MRF4、以MRF4為優化合成的肌肉特異啟動子、以FAD3為人源化n-3去飽和酶 基因、IRES為內部核糖體進入位點、DsRed紅色熒光蛋白基因和終止信號區SV40polyA，所 述獨立基因轉移體無原核主干載體序列。
[0016] 其中，所述的基因轉移體的全序列為SEQ N0. :17。
[0017] 其中，置換CMV的肌肉特異性啟動子MRF4的序列為SEQ ID NO :9 ;根據"肌肉特組 織特異性啟動子生物信息學設計路線"優化MRF4序列，在兩端添加Kpnl和Smal酶切位點 及保護堿基，將序列送至takara公司，進行人工合成。
[0018] 其中，置換U6的MRF4的序列為SEQ ID N0 :9 ;通過如下引物進行PCR獲得：
[0019] MRF4-F 正義鏈，5，到 3' ：SEQ ID N0 :1 ;
[0020] MRF4-R 反義鏈，5，到 3' ：SEQ ID NO :2。
[0021] 其中，FAD3的序列為SEQ ID NO :10 ;通過如下引物進行PCR獲得：
[0022] FAD3-F 正義鏈，5，到 3' ：SEQ ID N0 :3 ;
[0023] FAD3-R 反義鏈，5，到 3' ：SEQ ID NO :4。
[0024] 其中，IRES的序列為SEQ ID NO :11 ;通過如下引物進行PCR獲得：
[0025] IRES-F 正義鏈，5'到 3' ：SEQ ID N0 :5 ;
[0026] IRES-R 反義鏈，5'到 3' ：SEQ ID NO :6。
[0027] 其中，DsRed基因為SEQ ID NO :12 ;通過如下引物進行PCR獲得：
[0028] DsRed-F 正義鏈，5'到 3' ：SEQ ID N0 :7 ;
[0029] DsRed-R 反義鏈，5'到 3' ：SEQ ID NO :8。
[0030] 還提供了一種三順反子肌肉特異雙向共表達基因轉移體的制備方法，包括如下步 驟：
[0031] S1、，人工合成 MRF4,并用 MRF4 置換初始載體 pMAR-shRNA-U6-CMV-FSTN 中的 CMV， 得 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN ;
[0032] S2、用克隆的 MRF4 置換 pMAR-shRNA-U6-MRF4-FSTN 中的 U6，得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN ；
[0033] S3、用克隆的 FAD3 置換 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FSTN 中的 FSTN，得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3 ；
[0034] S4、進行 IRES 序列的克隆，并連入 FAD3 下游，得 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IR ES ；
[0035] S5、克隆 DsRed，連入 IRES 下游，構建質粒載體 pMAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES -DsRed ；
[0036] S6、用Xhol I、AfI II對步驟S5所得的質粒載體雙酶切，電泳分離，獲得三順反子 肌肉特異雙向共表達基因轉移體 MAR-shRNA-MRF4-MRF4-FAD3-IRES-DsRed-SV40po 1 yA。
[0037] 其中，所述步驟S1具體包括如下步驟：
[0038] SI 1、根據"肌肉特組織特異性啟動子生物信息學設計路線"優化MRF4序列，在兩 端添加Kpnl和Smal酶切位點及保護堿基，并將序列送至takara公司，進行人工合成；
[0039] S12、將步驟S11合成的MRF4肌肉特異啟動子序列連接到PMD19T-simple載體中， 挑取穿刺菌加