一種抗除草劑草甘膦基因表達結構及其在玉米中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬農作物的生物工程育種領域，具體說，涉及一種抗除草劑草甘膦基因表 達結構及其在玉米中的應用，是通過人工合成除草劑草甘膦抗性基因、定向重組到玉米基 因高效表達的插盒中，通過轉基因技術獲得耐草甘膦特性優異的轉基因玉米。
【背景技術】
[0002] 草害是影響作物生長和產量的重要因素。據聯合國糧農組織（FA0)統計，全世界 每年因病蟲草害致農作物產量下降三分之一，其中因草害損失11%。要滿足日益增長的需 求，糧食生產的集約化和提高單位面積上的生產力是首選措施，而這需要加強草害的防治。 針對草害，傳統防治措施主要是依靠中耕除草和除草劑施用，成本較高。
[0003] 玉米是重要的糧食和飼料作物，也是重要的工業原料和能源作物，在我國經濟中 起著十分重要的作用。我國玉米種植區域廣，雜草種類及危害情況也極為復雜，并且因耕作 制度和除草方式使雜草群落不斷演替而危害玉米生長。雜草與玉米相伴而生，地上爭奪陽 光和空間，妨礙田間通風透光，造成玉米群體光能利用率低；地下則爭奪土壤養分、水分，導 致玉米植株營養不良，嚴重影響了玉米的產量和品質。同時，許多雜草是農作物病蟲的天然 寄主，易導致病蟲害在玉米田間傳播。
[0004] 自從1942年除草劑2, 4-D問世以來，雜草防治由人工除草進入化學除草時代。此 后，除草劑新品種層出不窮，應用范圍也越來越廣，有效的提高了勞動生產率、降低了成本。 1971年草甘磷上市，該除草劑為內吸傳導型廣譜滅生性除草劑，除草效果好，且在環境中容 易降解。草甘膦能競爭性抑制莽草酸途徑中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS) 的活性，從而阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，擾亂生物體正常的氮代謝 而使其死亡。其在24-28小時內就可擴散到整棵植株，使其2-10天內出現枯萎或死亡。由 于草甘膦是一種非選擇性除草劑，對農作物同樣有毒害作用，噴施后對作物的光合作用和 代謝過程會產生一定的影響，這極大限制了草甘膦在農業生產中的應用，因此，耐除草甘膦 轉基因作物的發展無疑有廣泛市場。1985年，Comai等從鼠傷寒沙門氏菌中分離出了抗草 甘膦的突變基因aroA并將其轉入煙草，首次獲得了耐除草劑的轉基因植物，之后有關抗草 甘膦新基因研究報道層出不窮，耐草甘膦轉基因作物也相繼研發成功并推廣應用。2011年， 耐除草劑性狀轉基因作物種植面積為9390萬公頃，占全球轉基因作物種植面積的59%。同 時也減輕了農藥濫用對農業環境的影響。
[0005] 耐草甘膦轉基因作物得以應用的兩個關鍵因素是：耐草甘膦基因的獲得以及該基 因在轉基因作物中的表達量能保證草甘膦在除草劑量施用下植株仍能生長發育正常。也就 是說，高抗草甘膦基因的發掘及利用是轉基因作物成功推廣的奠基石。目前，在轉基因耐除 草劑植物中草甘膦抗性基因即突變的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)基因 最為廣泛應用。
[0006] 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)和 3-磷酸莽草酸（S3P)合成5'-烯醇式丙酮酸-3'-磷酸莽草酸。可分為兩類（Ming He 等，2001)。以鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌為代表的這一類具有相同氨基酸保守序列的EPSPS 合酶被稱做Class I EPSPS。以農桿菌CP4、假單胞菌PG2982為代表的稱為Class II EPSPS。兩類EPSPS擁有各自的結構特征，且氨基酸序列相似性低于50%。從這些物種中克 隆出的EPSPS基因也相應分成了兩類。一些大型國際生物技術公司已明確了 epsps基因中 對草甘膦抗性有影響的氨基酸保守序列，并申請了相關專利，構筑了嚴密的知識產權保護 網。就草甘膦抗性來講，Class II EPSPS成員突變體對草甘膦表現出的抗性普遍較高。如 大面積推廣的抗草甘膦玉米所含的抗性基因就是從根癌農桿菌CP4中克隆出的CP4-ep Sps 基因（Class II)。我國在草甘膦抗性菌株和基因資源的研究方面也取得重要進展。朱玉 和劉柱等分別從草甘膦極端污染的環境中分離到了兩株抗性極強的菌株-熒光假單胞菌 G2(psedomonas fluorescens G2)和可變鹽單胞菌HTG7(Halomonas Variabilis HTG7)，并 克隆出2個結構新穎、功能明確的草甘膦抗性新基因。它們均不含專利保護的氨基酸序列 及突變位點，與之前已報道的Class I和Class II家族中的草甘膦抗性基因相似性低，顯 示了有良好的開發應用前景。該基因也被廣泛應用于轉基因大豆、棉花和油菜等多種植物。 Heck等（2005)構建了一個分別用水稻actin 1啟動子和花椰菜花葉病毒P35s啟動子啟動 CP4-印sps基因的表達載體，轉基因玉米在高于生產應用濃度2~4倍劑量的除草劑噴施 條件下均有植株正常生長，獲得了高抗草甘膦的轉基因株系，并完成了商品化。Howe (2002) 等將突變后的玉米印sps基因和G0X基因一同轉入玉米細胞，產生的愈傷組織經過ImM和 3mM草甘膦各篩選一個月后，再生出玉米轉化植株；在植株約61cm高時噴施0. 036升/公 頃的除草劑農達（40%草甘膦）篩選抗性植株，獲得了抗性品種，并完成了商品化。我國 對耐草甘膦轉基因作物的研究也取得很大進步。具有我國自主知識產權的G2-ep Sps基因 被轉入煙草和棉花后，獲得可耐受草甘膦的能力（劉錫娟等，2007)。2008年，赫福霞等， 對G2-印sps進行植物密碼子優化后轉入玉米，獲得了抗草甘膦轉基因玉米，并建立了以 2mG2-印sps基因（優化后基因）為篩選標記的玉米轉化體系。在轉化實驗中，愈傷組織篩 選壓力為ImM的草甘膦異丙胺鹽篩選15天。2010年余桂容等將2mG2-ep SpS基因轉入10 個優良玉米自交系，并確定了不同自交系草甘膦的最適篩選濃度（變幅在1%。-1. 25%。）， 但未達到生產上應用濃度2%。，在隨后發表的文章中又將2mG2-印sps和R79-印sps (從宏 基因組文庫中分離的R79菌株中克隆）構建到同一表達載體中轉入玉米，獲得最高可耐受 6%。的草甘膦濃度的轉基因玉米。劉柱等（2004)從草甘膦的耐受濃度高達900mM可變鹽單 胞菌中克隆出新的epsps基因，提示該基因有很好的應用前景。
[0007] 除草劑抗性基因能否在受體植物中高效表達產生理想的抗性性狀，不僅取決于基 因的來源及堿基序列的特異性、轉基因的拷貝數，而且決定于轉基因表達結構和轉基因表 達產物的穩定性。轉基因表達結構一般是由"啟動子-基因編碼區-轉錄終止區"組成，在 單子葉植物中，高效表達的啟動子一般與基因的內含子序列緊鄰，內含子可明顯提高基因 表達豐度，植物基因工程常用的啟動子Pubiqintin、Pactin均含有內含子序列。轉錄終止 區不僅保證了編碼區的正確轉錄，而且對轉錄產物的穩定性即半衰期有很大影響。構建理 想的轉基因表達結構可使轉基因高效轉錄，且產物穩定。轉基因產物的穩定性還取決于基 因編碼區的堿基組成，不同進化階梯上的生物，其基因的堿基組成可有明顯不同，異源的堿 基組成差異較大的轉錄產物往往會表現出不穩定現象，即易被降解，半衰期短。另外，物種 對密碼子具有不同程度的偏好性，即一些密碼子在特定的物種中使用頻率高，而另一些密 碼子在特定物種中使用頻率低，這種特性會影響特定蛋白的合成速率。因此，要實現轉基因 在受體植物中高效表達并產生理想性狀，需要基因編碼區的堿基序列適合于該基因的高效 表達，即用受體物種偏愛的密碼子取代在受體物種中利用率低的密碼子、改變影響mRNA壽 命的DNA片段；需要將基因編碼區與高效表達的啟動子融合；需要在基因的3'區連上能提 高mRNA壽命的3'尾巴區。轉基因的插入位點也明顯影響轉基因的表達強度，因此，也需要 獲得大量的轉化事件，從中選擇合乎目標的轉基因體。
【發明內容】
[0008] 針對目前的研究現狀，本發明的目的是提供一種抗除草劑草甘膦基因表達結構及 其在玉米中的應用。
[0009] 本發明所述的抗除草劑草甘膦基因表達結構，其特征在于：所述基因表達結構由 玉米Ubiqitinl基因啟動子-人工合成的草甘膦耐性基因mEPSPS-水稻GluB5基因終止區 TgluB5核苷酸片段構成；其中，所述草甘膦耐性基因mEPSPS的核苷酸序列如SEQID No. 1 所示，所述水稻GluB5基因終止區TgluB5核苷酸片段的序列如SEQID No. 3所示，所述玉 米Ubiqitinl基因啟動子的核苷酸序列