一種蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶及基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種含有蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶基因的克隆表達以及通過大 量表達以及高效親和層析純化方法得到純度較高的亞硝酸鹽還原酶（NiR)，從而對重組蛋 白的性質進行研究。
【背景技術】
[0002] 亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物質，主要原因有2個：（1)大量攝入亞硝酸鹽對 人體有害，亞硝酸鹽的急性中毒作用是導致高鐵血紅蛋白癥（Methemoglobin)，可產生常 見的亞硝酸鹽急性中毒癥狀，主要表現為組織缺氧、紫紺，伴隨口唇、指甲和皮膚的顏色 改變等現象；（2)亞硝酸鹽還會造成人體或動物的慢性危害，亞硝酸鹽在適宜的條件下， 可與食品中蛋白質的分解產物胺進行反應，生成N-亞硝基化合物，目前已經合成該類化 合物有100多種，已經證實其中約80%對動物有強致癌性，可誘發大腸、胃、肝、食道等器 官的癌癥。為預防亞硝酸鹽的急性和慢性危害，探索降解食品中潛在致癌物亞硝酸鹽的 方法和機制，非常必要。NiR是脫氮過程中的第一限速酶，催化亞硝酸鹽降解為一氧化 氮，大部分反硝化細菌中都存在NiR，使得其可以高效快速有效降解亞硝酸鹽。許多非食 用細菌中NiR的分離純化已被報道：Vigara從1944mg Monoraphidium braunii粗蛋白 中純化得到 〇.29mg 鐵氧還原蛋白 _NiR[Vigara J，Garc：[a-S(inchez MI，Garbayo I，et al. Purification and characterization of ferredoxin - nitrite reductase from the eukaryotic microalga Monoraphidium braunii. Plant Physiology and Bioche mistry，2002,40(5):401_405] ;Ichiki 從 6170mg 的 Haloarcula marismortui 粗蛋白 中僅得到 1. 43mg 的 NiR[Ichiki H and Tanaka Y. Purification, characterization, a nd genetic analysis of Cu-containing dissimilatory nitrite reductase from a denitrifying Halophilic Archaeon，Haloarcula marismortui. Journal of Bacteriol ogy，2001，183 (14) :4149 - 4156] ;Inatomi 對 Haloferax denitrificans 中的 NiR 進行純 化發現1060mg粗蛋白中只能得到0.08mg目的蛋白[Inatomi K and Hochstein LI.The purification and properties of a copper nitrite reductase from Haloferax denitrificans. Current Microbiology，1996, 32:72-76]，國內外未見從錯樣芽抱桿菌中 提純NiR的研究。由于粗酶液中蛋白種類太多，而目的蛋白含量太低，導致純化工作困難。 為了提高NiR的含量，克隆表達技術得到了廣泛的應用。通過克隆NiR基因然后在宿主細 胞中大量表達，同時通過質粒使得重組蛋白帶有特定標簽從而簡化純化過程。
【發明內容】
[0003] 為研究蠟樣芽孢桿菌中NiR的性質，解決由于蠟樣芽孢桿菌中NiR含量低而難于 純化的問題，本發明通過對其NiR編碼基因的克隆表達來實現該蛋白在大腸桿菌中的大量 表達，同時通過親和層析法得到大量純度較高的NiR，從而實現對LJ01中NiR的提純。 [0004] 為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0005] -種蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因，其核苷酸序列如NO. 1所示。
[0006] -種蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶，由權利要求1所述基因編碼的蛋白質。
[0007] 含有上述蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶基因的重組質粒，該重組質粒中含組氨酸 標簽。
[0008] -種蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶的制備方法，包括如下步驟：
[0009] (1)以NCBI中蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶編碼基因為模板，進行上下游引物設 計，設計的酶切位點為Ncol、Sail;
[0010] (2)提取蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)LJ01的DNA，并以此為模板，通過PCR 技術擴增蠟樣芽孢桿菌LJ01亞硝酸鹽還原酶的基因片段；所述蠟樣芽孢桿菌LJ01的保藏 編號為 CGMCC N0. 9360;
[0011] (3)利用Ncol、Sail工具酶將擴增片段和質粒pET-32a(+)于37°C下分別切成具 有兩個粘性末端的片段；采用回收試劑盒回收以上兩個片段，并用T4DNA連接酶連接，再轉 入重組大腸桿菌中，利用抗生素氨芐青霉素進行篩選即獲得陽性工程菌；
[0012] (4)將上述工程菌經誘導表達，采用親和層析法純化，即得到蠟樣芽孢桿菌亞硝酸 鹽還原酶。對經親和層析純化后的NiR進行變性和非變性聚丙烯酰胺電泳，同時進行GPC 來檢測其純度和分子量。對重組蛋白進行金屬含量的測定，從而確定其活性中心。對重組 蛋白的氧化態和還原態進行UV-可見光全波長掃描，檢測其在可見光區域的最大吸收峰。
[0013]所述上游引物為5' -GATGCCATGGATGAGITATGAAAAAGTAT-3'（Ncol)，下游引物為 5, -ACGCGTCGACCTAAGACGCTATTACTTCT-3，（Sail)。
[0014] 所述誘導表達為加入誘導劑IPTG進行誘導，且誘導濃度為0. 1~1. 0mmol/L。
[0015] 所述蠟樣芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶在降解亞硝酸鹽中的應用，在降解過程中需加 入電子供體蛋白。
[0016] 所述的電子供體蛋白為細胞色素c或從蠟樣芽孢桿菌LJ01中提取得到的電子供 體蛋白，其添加量為亞硝酸鹽還原酶的1/5~1/15。
[0017] 本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果：
[0018] (1)本發明通過對經IPTG誘導的含空質粒和重組質粒大腸桿菌及不加IPTG誘導 的含重組質粒大腸桿菌粗酶液進行SDS-PAGE分析及親和層析技術來驗證工程菌可以誘導 表達亞NiR重組蛋白。
[0019] (2)本發明可以通過IPTG誘導表達得到大量的細胞內NiR，可以應用到工業中進 行大量生產。
[0020] (3)本發明利用親和層析作用純化得到純度較高的NiR重組蛋白，并通過GPC和非 變性聚丙烯酰胺電泳檢測其純度，解決了從蠟樣芽孢桿菌中分離出純度和含量較高NiR的 難題。
[0021] (4)本發明得到的工程菌表達的重組蛋白要添加電子供體蛋白才能有效地降解亞 硝酸鹽。
[0022] (5)該克隆表達得到的大量的NiR重組蛋白可以用于食品中的亞硝酸鹽的降解； 由于其最適pH為6. 5-7. 5,所以也用于非酸性環境中亞硝酸鹽的降解；還可以用于養殖水 體中亞硝酸鹽的降解。
[0023] 錯樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)LJ01的保藏信息：錯樣芽孢桿菌LJ01于2014 年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏號 CGMCC No. 9360 ;該保藏證明已在中國專利CN104212739A中提交。
【附圖說明】
[0024]圖1為實施例1中利用蠟樣芽孢桿菌LJ01基因組DNA為模板進行PCR擴增產物 鑒定圖，其中M為DNA分子量標準；1，2，3為PCR擴增產物。
[0025] 圖2為實施例3中構建的重組菌平板生長圖，其中a為感受態細胞加無菌水組（陰 性對照組），b為感受態細胞加空質粒組（陽性對照組），c為感受態細胞加重組質粒組（重 組質粒組）。
[0026] 圖3為實施例3中構建的重組菌針對NiR基因的PCR目的片段鑒定圖，其中M為 DNA分子量標準；1~10為從平皿C上長出的重組菌菌落的PCR擴擴增后的目的片段。
[0027] 圖4為實施例4中構建的重組質粒進行酶切鑒定圖，a為單酶切鑒定圖，