分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的特異性引物及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的特 異性引物及方法，具體為一種鑒別草珊瑚你?/?. )yVaAai，金粟蘭Chloranthusspicatus,Chloranthusserratus, Chloranthushenryi 的分子定量分析的特異性標記引物，以及一種利用該特異性引物對草珊瑚與金粟蘭，及己 和寬葉金粟蘭等3種混合品快速定量分析方法。
【背景技術】
[0002] 草珊瑚5krcai?<irayVaAai，俗稱腫節風，通常用于治療花斑癬、 紫癜、風濕性關節痛、外傷。現代研究表明有治療癌癥、抗腫瘤、抗炎、抗病毒和非特異性免 疫增強上等藥理作用。然而，野生植物種質資源近年來已經減少，由于金粟蘭，寬葉金粟蘭、 及己外形與草珊瑚極其相似，很容易與草珊瑚相混淆。但是他們有不同的屬性和藥用價值， 這些易混植物也都有相應的肝毒性作用，及己在嚴重肝毒性病例報告和動物的毒性研究中 已經證實有顯著肝毒性，這限制了它在臨床上的應用。
[0003] 雖然草珊瑚新鮮葉片可以通過靜脈、附屬物和葉的非腺毛維管束結構之間的顯微 鑒定差異從其混淆品中鑒別出來，但是粉末或粉碎片形式的草珊瑚和易混植物通過形態學 和組織學技術是很難識別的。在過去的幾年中，利用化學分析技術如TLC、HPLC、MS等識別 草珊瑚及其相關制劑已經有所記載。雖然這些方法在某種程度上可以補充形態學或組織學 鑒定的局限性，但化學指紋圖譜只能檢測部分化合物，只能提供有限的物種組成信息，不能 給我們提供完全鑒別出草珊瑚的方法，而且很難進行定量分析，特別是在和它極為相似的 物種相互混雜時。因此，建立草珊瑚與金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭等產品混合時進行定量分 析方法，比便對其相關產品對監測質量至關重要。
[0004] 隨著分子生物學的發展，DNA分子標記如RAPD、ISSR和SSR等分子標記，ITS (Internaltranscribedspacer)等DNA條形碼技術提供了可靠的識別藥材的方法。然而， 這些基于基因組DNA的分子標記技術容易受到基因組DNA降解的影響，由于核基因組DNA 比葉綠體DNA拷貝數少，在加工過的藥材中更容易遭破壞而導致無法通過其分子標記技術 進行鑒別。葉綠體DNAtrnL-F區域的包含trnL(UAA)內含子和間隔，即trnL(UAA)-trnF (GAA)區作為DNA條形碼，它可以很容易利用通用引物進行擴增，這一序列已被證明可用于 對多種植物在種水平的識別，被廣泛用于植物產品的檢測。
[0005] 本課題組在前期研究中也發現，對于干燥或經加工過的藥材，基于葉綠體DNA trnL-F區域的鑒別技術比基于核基因組DNA的分子標記技術更為穩定有效。本研究對草 珊瑚、金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的trnL-F區序列進行測序，分析其序列結構和特征，尋找 單核苷酸多態性（singlenucleotidepolymorphismSNP)分子標記，設計分別識別草珊 瑚，金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的特異識別引物，建立多重PCR技術，鑒定引物的特異性，在 此基礎上，利用這些特異引物對，構建實時熒光定量PCR，可快速簡單定量分析草珊瑚與金 粟蘭、寬葉金粟蘭和及己3種混淆品的方法。本發明為草珊瑚與3個混淆種的分子定量分 析提供了技術支持，對相關中藥飲片進行定量分析具有非常重要的意義，檢索未見草珊瑚 與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己等3種混淆品的分子定量的發明專利申請。
【發明內容】
[0006] 本發明的主要目的是提供一種可準確，快速，簡單定量分析草珊瑚與金粟蘭、寬葉 金粟蘭和及己3種混淆品的技術，為相關草珊瑚飲片與這3種混淆品的混合品定量分析提 供技術支持。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的的特異性引物，特異識別草珊瑚的上游特異 性引物SgF:5' -TGAITCTGATAGAIT-TITGAAGAAITGA- 3' 與下游引物trnL-Fb:5' -GGGACTTGAACCCTCACGATT- 3' ；同時特異性識別金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭的特異上游引物 ChF:5'_ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC- 3'與下游引物trnL-Ff:5'_ATTTGAACTGGT GACACGAG- 3'。
[0008] 分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的方法，構建熒光定量PCR進行40個循環，反 應體系 如下：總量為20yL，從植物中提取10ng的DNA作為擴增模版，10yL2XSYBR GreenReal-timePCRMasterMix(TaKaRa)，0.2yM上游特異引物，0.2yM下游通用引 物，其余為無菌水；反應程序如下：在實時定量PCR儀器（ABI7900)種，50°C預變性2分鐘， 95°C預變性10分鐘，在95°C變性15s，引物退火58°C15s和在72°C延伸30s，40個循環。 [0009] 具體方法如下： (1)設計特異識別引物，并驗證其特異性 根據前期測序實驗所得的草珊瑚、金粟蘭，及己和寬葉金粟蘭的trnL-F基 因序列，分析其特異SNP位點，分別設計草珊瑚的上游特異性引物38?(5'_ TGAITCTGATAGAITITTGAAGAAITGA- 3'）、設計可同時特異性識別金粟蘭，及己和寬葉金粟 蘭的特異上游引物ChF(5'-ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC- 3'）與下游通用引物trnL-Ff (5' -AITTGAACTGGTGACACGAG- 3'），構建多重PCR體系：總量為 20yL，取 10ng 植物中提取的DNA作為模版，加入1yL1XTransStartTopTaqDNA聚合酶反應液，2yL 10XTransStartTopTaqBuffer，dNTP2. 5mM, 0.2yM下游引物trnL-Ff和上游的兩個特 定的引物SgF、ChF各0. 1yM，其余為無菌水。構建多重PCR體系，反應程序如下：在95°C 預變性2分鐘，在95°C變性30s，在50°C下引物退火30s和在72°C下延伸2分鐘，進行35 個循環，最后一個循環在72°C延伸7分鐘，以確保完整的延伸產品。只有草珊瑚取得了 575 bp，金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭生成特定的216bp，混合樣品則同時產生575bp與216bp等 2條條帶。確認引物的特異性。
[0010] (2)定量分析方法： 草珊瑚的上游特異性引物SgF(5'_TGATTCTGATAGATT-TTTGAAGAATTGA- 3'）與下游引 物trnL-Fb(5 ' -GGGACTTGAACCCTCACGATT- 3 '）形成特異識別草珊瑚的引物對、同時特異 性識別金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭的特異上游引物ChF( 5 ' -ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC -3'）與下游引物trnL-Ff(5' -AITTGAACTGGTGACACGAG- 3'）形成特異識別金 粟蘭、及己和寬葉金粟蘭等3種樣品的引物對，分別構建實時定量PCR體系。構建熒光定量 PCR進行40個循環，反應體系如下：總量為20yL，從植物中提取10ng的DNA作為擴增 模版，10yL2XSYBRGreenReal-timePCRMasterMix(TaKaRa)，0? 2yM上游特異引 物與0. 2yM下游通用引物，其余為無菌水；反應程序如下：在實時定量PCR儀器（ABI7900) 中，50°C預變性2分鐘，95°C預變性10分鐘；在95°C變性15s，引物退火58°C15s和在 72°C延伸30s，40個循環。引物SgF和trnL-Fb用于混合產品中草珊瑚的定量分析；引物 ChF和trnL-Ff用于混合產品中的金粟蘭屬（金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭）的定量分析。所 有引物的濃度均為0. 2yM。實時定量PCR方法用于定量分析方法可由相對定量分析方法 R=2AAet法推導出來，由于同一DNA樣品中以其總DNA為模板進行擴增，混合樣品總模版 DNA相應的Ct(total)值是恒定的，即特定一個混合樣品中的Ct(total)值是不變的。則 摻雜物數量的比率在同一個樣本中可以通過這個公式計算：
Ct(total))為總混合樣本的Ct值，Ct(Sg)為引物SgF、trnL-Fb的Ct值，即代表草 珊瑚含量的Ct值，Ct(Ch)為引物trnL-Ff、ChF的Ct值，即代表三種混淆品含量的Ct值。
[0011] 本發明的優點在于： 由于僅根據某些特征活性成分含量進行定量分析，易受植物成長環境等外在條件的影 響，很難進行準確定量。本方法基于遺傳物質DNA的含量進行分子定量，不受藥材的產地等 外在因素的影響，相對于化學定量方法，更為準確，也更為簡單方便。
[0012] 由于葉綠體DNA比基因組DNA的拷貝數更多，在干燥及加工后的產品中更為穩定， 本方法利用葉綠體DNA作為定量