血管內皮細胞祖細胞的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養方法，具體地，涉及一種血管內皮細胞祖細胞的培養方法。
【背景技術】
[0002]干細胞指的是能夠自我更新、分裂以及分化成其它細胞類群的一種細胞。從干細胞在發育中所處的階段來看，干細胞可以分為胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES細胞)和成體干細胞(adult stem cell)。胚胎干細胞是一種多能干細胞(pluripotentstem cell)，可以無限增殖并分化成人體兩百多種類型細胞、形成機體的組織和器官，SP能分化成多種細胞和組織的潛能的干細胞。1981年Evans和Kaufman從小鼠內細胞團(inner cell mass, I CM)分離胚胎干細胞以來，ES細胞研究成為各國科學家研究的熱點，近年來圍繞干細胞定向分化成其它類型細胞的研究如雨后春筍般出現(1981 ;Nature292 (5819): 154-6)。1998年Thomson成功分離、培養人類胚胎干細胞，為干細胞的人類醫學應用提供了可能(1998 ；Science 282 (5391):1145-7)。2006年日本京都大學的山中伸彌等率先報道了 iPS細胞的研究(2006;Cell 126 (4): 663-76)，他們通過向終端分化的小鼠表皮成纖維細胞中導入四種轉錄因子0SKM(0Ct4，SOX2，Klf4，C-MyC)，可以誘導終端分化的細胞成干細胞狀態，即iPS細胞(induced pluripotent stem cell)，此后出現了各種制造iPS細胞的技術路徑。人工誘導的多能干細胞具有與胚胎干細胞相似的分化能力、表觀遺傳修飾和細胞形態等其他特征，為干細胞的研究提供了新的思路。
[0003]干細胞具有多種分化潛能，可以在體外長期保存，具有自我更新和無限增殖潛力。干細胞的這些特點為科學研究和醫學應用提供了很好的細胞來源。目前干細胞主要研究與應用方向主要包括:1)細胞治療，已有報道可以將干細胞定向分化成肝細胞(公告號為CN102666853A的專利)和心肌細胞(公告號為CN103602633A和CN104293730A的專利)等其他類型的細胞，為細胞治療提供了大量的有生理功能的細胞來源；2)再生醫學領域，傳統再生醫學如器官移植是通過供體者器官移植到受體體內，這種移植手段會產生很多問題，如免疫排斥反應和感染等。通過體外人工誘導病人自己的干細胞定向分化成成熟的具有生理功能的器官可以有效地解決這些負面效應，為再生醫學提供新方法。3)藥物開發，體外誘導干細胞定向分化成特定類型細胞后加入各種藥物，研究藥物對特定組織或細胞的毒性，節省大量研究成本，為臨床應用提供大量數據。
[0004]血管是體內負責運輸血液、氧氣和營養物質等的重要通道，血管出現問題，可能造成組織和器官衰竭甚至壞死而危及生命，如血管內皮細胞損傷可以誘導高血壓和冠心病等血管疾病的發生。心血管疾病是威脅人類健康的常見疾病，位于我國疾病發病率的首位。同時，科學研究也需要大量血管，為藥物對血管組織損傷實驗提供材料。另外，體外人造組織器官需要血管運輸營養物質為器官生長提供養分。此外，臨床和再生醫學領域也迫切需要各種血管組織細胞。鑒于上述情況，如何在體外得到大量的血管組織細胞顯得極為重要。多能干細胞能夠為我們提供大量的種子細胞，可以定向分化成血管內皮細胞(endothelialcell)和祖細胞(endothelial progenitor cell)，從而能夠為修復治療提供大量細胞、為體外構建組織模型提供血管細胞來源，也能夠為藥物篩選和藥物毒性研究提供很好的材料。
[0005]目前，多能干細胞的培養過程中使用的培養基中往往含有動物源成分，尤其是中內胚層前體細胞的培養，如使用MEF (小鼠胚胎成纖維細胞，Mouse Embryonic Fibroblast)滋養層細胞和培養基中的動物血清。雖然上述培養基可以保證干細胞及其誘導分化的細胞具有優異的自我更新能力，但是由于培養基中引入大量動物源性物質，給干細胞及其誘導分化的細胞自我更新及分化過程帶來了不確定因素，增加了誤差；同時可能引入動物源性污染，如支原體污染等；另外，在細胞治療的過程中還會誘發免疫反應。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種血管內皮細胞祖細胞的培養方法，該培養方法中使用的未含有動物源成分，并且該培養基能夠為培養細胞提供足夠的營養物質和穩定的生存環境，從而能夠高效地將多能干細胞誘導分化形成血管內皮細胞祖細胞，并且該血管內皮細胞祖細胞形成有高度類似于人類臍帶血管內皮細胞的血管狀網格。
[0007]為了實現上述目的，本發明提供了一種血管內皮細胞祖細胞的培養方法，該培養方法包括:
[0008]I)將多能干細胞于培養基A中誘導分化形成中內胚層前體細胞；
[0009]2)將中內胚層前體細胞于培養基B中誘導分化形成血管內皮細胞祖細胞；
[0010]其中，培養基A含有DMEM培養基、F12培養基、砸酸鈉、碳酸氫鈉、維生素C、胰島素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制劑；培養基B含有DMEM培養基、F12培養基、砸酸鈉、碳酸氫鈉、維生素C、胰島素、血管內皮生長因子和轉化生長因子β信號通路抑制劑。
[0011 ] 通過上述技術方案，本發明提供的培養方法中的培養基包括培養基A和培養基B，這兩種培養基中各組分通過協同作用可以向培養細胞提供足夠的營養物質和穩定的生存環境使得培養細胞具有優異的自我更新能力，同時該培養基中未使用動物源成分進而有效地規避了由于動物源性物質對培養細胞的自我更新及分化過程帶來了不確定因素以及對培養細胞造成污染的情況的發生，并且能夠在細胞治療的過程中完全避免誘發免疫反應的發生。在上述內容的基礎上，本發明提供的方法能夠有效地將人類多能干細胞誘導分化為血管內皮細胞祖細胞，進而使得血管內皮細胞祖細胞能夠實現大規模的工業應用，并且該血管內皮細胞祖細胞能夠形成高度類似于人類臍帶血管內皮細胞的血管狀網格，進而使得該血管內皮細胞祖細胞可以在細胞治療，體外組織構建、體外移植物構建、藥物篩選和血管生物學研究中的得以廣泛應用。
[0012]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0013]附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中:
[0014]圖1是人類多能干細胞的形態特征圖；
[0015]圖2是檢測例I中基于⑶31+⑶34+表征細胞Dl的形態特征圖；
[0016]圖3是人類多能干細胞的細胞系圖；
[0017]圖4是檢測例I中人類多能干細胞誘導分化后5天⑶31和⑶34的表達檢測結果圖；
[0018]圖5是人類臍帶血管內皮細胞系圖(作為陽性對照);
[0019]圖6是檢測例2中細胞Dl的類血管網絡生成結果。
【具體實施方式】
[0020]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0021]本發明提供了一種血管內皮細胞祖細胞的培養方法，該培養方法包括:
[0022]I)將多能干細胞于培養基A中誘導分化形成中內胚層前體細胞；
[0023]2)將中內胚層前體細胞于培養基B中誘導分化形成血管內皮細胞祖細胞；
[0024]其中，培養基A含有DMEM培養基、F12培養基、砸酸鈉、碳酸氫鈉、維生素C、胰島素、激活素A、骨形成蛋白4、糖原合成酶激酶-3抑制劑；培養基B含有DMEM培養基、F12培養基、砸酸鈉、碳酸氫鈉、維生素C、胰島素、血管內皮生長因子和轉化生長因子β信號通路抑制劑。
[0025]在上述培養基A中，各組分的含量可以在寬的范圍內選擇，但是為了使得培養基A能夠為培養細胞提供更加充足的營養物質和更加穩定的生存環境，優選地，在培養基A中，DMEM培養基與F12培養基的體積比為1:1_1:4，維生素C的濃度為1_100 μ g/ml，胰島素的濃度為1-100 μ g/ml，激活素A的濃度為5-100ng/ml，骨形成蛋白4的濃度