一株二孢擬奧德蘑菌株及其粗多糖的提取和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及真菌領域，特別是指一株二孢擬奧德蘑菌株及其粗多糖的提取和應 用。
【背景技術】
[0002] 氧化反應與人體的新陳代謝息息相關。當人體正在利用氧氣進行新陳代謝反應 是，不可避免的會產生一些不穩定的自由基，當體內的自由基達到一定程度時，就會損害人 體健康。為了減輕或者消除氧化反應的危害，抗氧化劑尤其是天然的抗氧化劑，越來越受到 重視。天然的抗氧化劑大多來源于水果或者蔬菜，在預防心臟病、癌癥等疾病，以及延緩衰 老、增進腦力、美容、護膚等方面均有顯著的效果。大型真菌是極具開發潛力的天然抗氧化 劑資源，從大型真菌中尋找新的清除體內自由基的活性物質，也是現代醫藥、保健行業發展 的方向。
【發明內容】
[0003] 本發明第一個方面提供一株二孢擬奧德蘑新菌株，命名為：二孢擬奧德蘑 Hymenopellis raphanipes SU41，并于2015年4月29日保藏于中國典型培養物保藏中心， 地址：中國湖北省武漢市武漢大學，其保藏號為CCTCC NO :M 2015269。
[0004] 所述的二孢擬奧德蘑SU41菌株其ITS序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0005] 本發明的第二個方面是提供本發明第一個方面所述的二孢擬奧德蘑菌株液體發 酵液的制備方法，包括以下步驟：將滅過菌的麥麩-葡萄糖培養基倒入無菌培養皿中制成 平板；待培養基凝固后，在無菌條件下，每平板接入活化菌種塊，培養后用打孔器從平板中 打取培養后的活化菌種塊，接入裝有麥麩-葡萄糖液體培養基的三角瓶中，搖床培養后即 得一級搖瓶菌種；之后將一級搖瓶菌種接入用于二級搖瓶發酵的麥麩-葡萄糖液體培養 基，搖床培養即得所述二孢擬奧德蘑菌株液體發酵液。
[0006] 進一步，活化菌種塊在平板培養基上的培養條件為：28°C，黑暗條件下培養 10-12d ;搖床培養所需的條件為：120r/min、28°C、黑暗條件下培養10-12d ;-級搖瓶菌種 接入的體積為二級搖瓶發酵所用麥麩-葡萄糖液體培養基體積的5%。
[0007] 進一步，所述的麥麩-葡萄糖培養基組成，以重量份數記為：麥麩50份，葡萄糖20 份，磷酸二氫鉀3份，硫酸鎂1. 5份，瓊脂15份，水1000份；所述的麥麩-葡萄糖液體培養 基組成，以重量份數記為：麥麩50份，葡萄糖20份，磷酸二氫鉀3份，硫酸鎂1. 5份，水1000 份。
[0008] 本發明的第三個方面是提供本發明第一個方面所述的二孢擬奧德蘑SU41菌株粗 多糖的提取方法，包括以下步驟：
[0009] (1)將二孢擬奧德蘑SU41菌株液體發酵液離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水洗滌 得到純菌絲體，烘干至恒重；
[0010] ⑵先將菌絲體粉碎，加入蒸餾水浸提，離心后收集上清液；
[0011] (3)合并上清液并減壓濃縮得濃縮液，加入濃縮液3倍體積的95%乙醇，4°C下醇 析24h，棄去上清液，再加入與初始濃縮液等體積的無水乙醇靜置30min后，棄去上清液，沉 淀洗滌3次，冷凍干燥，即得二孢擬奧德蘑SU41粗多糖。
[0012] 進一步，所述步驟（1)中，所述的沉淀用蒸餾水洗滌2-4次。
[0013] 進一步，所述步驟（2)中，加入的蒸餾水的質量為菌絲體質量的50倍，重復浸提3 次；浸提過程中控制溫度50-70 °C，浸提2-4h。
[0014] 進一步，所述步驟（3)中減壓濃縮至上清液體積的1/300 ;洗滌沉淀所用的試劑依 次為無水乙醇、丙酮和乙醚。
[0015] 本發明的第四個方面是提供本發明第三個方面所述的所述二孢擬奧德蘑SU41粗 多糖在制備抗氧化劑方面的應用。
[0016] 本發明的有益效果：
[0017] 本發明所述的新菌株二孢擬奧德蘑Hymenopellis raphanipes SU41，從野生的子 實體中分離獲得，并于2015年4月29日進行了菌株保藏，保藏于中國典型培養物保藏中 心，地址在中國湖北省武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO:M 2015269。從所述的二孢 擬奧德蘑SU41菌株中提取的多糖類物質，經多次試驗驗證，具有較好的抗氧化作用，在制 備天然抗氧化劑方面具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0018] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以 根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0019] 圖1為不同碳源下二孢擬奧德蘑SU41菌落生長情況；
[0020] 圖2為不同氮源下二孢擬奧德蘑SU41菌落生長情況；
[0021] 圖3為不同溫度對二孢擬奧德蘑SU41菌絲生長的影響；
[0022] 圖4為不同溫度下二孢擬奧德蘑SU41菌落生長情況；
[0023] 圖5為不同pH值對二孢擬奧德蘑SU41菌絲生長的影響；
[0024] 圖6為不同PH處理的二孢擬奧德蘑SU41菌落生長情況；
[0025] 圖7為二孢擬奧德蘑SU41菌株粗多糖對超氧陰離子自由基的清除效果；
[0026] 圖8為二孢擬奧德蘑SU41菌株粗多糖對羥自由基的清除效果；
[0027] 圖9為二孢擬奧德蘑SU41菌株粗多糖對DPPH自由基的清除效果。
【具體實施方式】
[0028] 下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0029] -、菌株的獲得
[0030] 試驗所用樣品采集自江西省南昌市郊區。取野生子實體，放入無菌室內，用無菌水 沖洗3次，進行表面消毒，隨即用消毒過的解剖刀從菌蓋中部縱切一刀，撕開，挑取菌蓋和 菌柄交界處的一小塊菌肉，移接到麥麩-葡萄糖斜面培養基上，加上棉塞，在28°C、黑暗條 件下培養3天，可見組織塊上長出絨毛狀菌絲，即得二孢擬奧德蘑菌株。
[0031] 二、形態特征
[0032] 子實體菌蓋直徑3-8. 5cm，平展，中部凸起或似臍狀；菌蓋光滑，淺褐色或深褐色 至暗褐色，有深色輻射狀條紋。菌肉白色，薄。菌褶白色，彎生，較寬，不等長。菌柄近圓柱 狀，長6-17cm，粗0. 3-1. 2cm，淺褐色，近光滑，有縱條紋，表皮脆骨質，內部纖維質且松軟， 基部膨大且延生成假根。孢子印白色。擔子具2小梗，擔孢子（13-)14-20Χ10-18μπι，寬橢 圓形至近球形。平板培養的菌絲潔白，氣生菌絲濃密。
[0033] 三、生物學特性
[0034] 培養條件：
[0035] (1)碳源對菌絲生長的影響：
[0036] 基礎培養基的組成為：碳源20g，大豆蛋白胨2g，磷酸二氫鉀0. 46g，磷酸氫二鉀 lg，硫酸鎂〇. 5g，瓊脂20g，水1000mL，碳源分別選擇麥芽糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、乳糖和葡 萄糖，接入二孢擬奧德蘑菌株后，28°C，黑暗條件下培養12d。二孢擬奧德蘑在6種碳源下 生長情況各不一樣，二孢擬奧德蘑以麥芽糖為碳源時，生長12d的菌落直徑最大；其后依次 是淀粉、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖（表1);差異顯著性測驗結果表明，麥芽糖對菌絲生長 速度的影響較其他碳源而言，具有顯著性差異（表1);同時從生長勢來看，以麥芽糖為碳源 時，菌落菌絲濃密、生長勢旺盛（圖1)。由此可見，二孢擬奧德蘑菌絲生長的最適碳源為麥 芽糖。
[0037] 表1不同碳源對二孢擬奧德蘑菌絲生長的影響Π τ± s.d.,.n=:5)
[0039] *平板培養12天的菌落直徑；**同列字母不同表示差異顯著。
[0040] (2)氮源對菌絲生長的影響
[0041] 基礎培養基的組成為：葡萄糖20g，氮源2g，磷酸二氫鉀0. 46g，磷酸氫二鉀lg，硫 酸鎂0. 5g，瓊脂20g，水1000mL。氮源分別選擇氯化銨、蛋白胨、硫酸銨、酵母膏、牛肉膏，接 入二孢擬奧德蘑菌株，28°C，黑暗條件下培養12d。二孢擬奧德蘑在供試的5種氮源中均能 生長。當以氯化銨為碳源時，生長12d的菌落直徑最大；其后依次是酵母膏、硫酸銨、牛肉 膏、蛋白胨（表2)。差異顯著性測驗結果表明，以氯化銨、酵母膏、硫酸銨、牛肉膏為氮源時， 對菌絲生長速度的影響沒有顯著性差異，但蛋白胨和其他幾種氮源比較，則有顯著性差異 (表2);從生長勢來看，當以酵母膏和牛肉膏為氮源時，菌落菌絲濃密、生長勢旺盛；以氯化 銨和硫酸銨為氮源時，菌落菌絲稀疏，生長勢較弱（圖2)。由此可見，酵母膏和牛肉膏為二 孢擬奧德蘑菌絲生長的合適氮源。
[0042] 表2不同氮源對二孢擬奧德蘑菌絲生長的影響（Γ± s.d., n=5 )
[0044] *平板培養12天的菌落直徑；**同列字母不同表示差異顯著。
[0045] (3)不同溫度對菌絲生長的影響
[0046] 使用麥麩-葡萄糖培養基，接入二孢擬奧德蘑菌株，黑暗條件下培養12d。培養溫 度為20°C時，菌絲生長較慢；隨著溫度的升高，菌絲生長速度逐步加快，并且在24°C時達到 最大值；當溫度大于28°C時，菌絲生長速度減慢，在32°C時，菌絲幾乎不生長（圖3)。差異 顯著性測驗結果表明，溫度28°C和32°C對菌絲生長速度的影響差異不顯著，但兩者和其他 溫度處理間有著顯著的差異；從生長勢來看，在24°C時，菌落菌絲較稀疏，在28°C時，菌落 菌絲濃密（圖4)。由此可知，二孢擬奧德蘑菌絲生長的最適溫度為28°C。
[0047] 所述麥麩-葡萄糖培養基的組成為：麥麩50g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂 I. 5g，瓊脂15g，水1000 g ;所述的麥麩水煮半小時，過濾，取濾汁。
[0048] (4)不同pH對菌絲生長的影響
[0049] 使用麥麩-葡萄糖培養基，接入二孢擬奧德蘑菌株，黑暗條件下培養12d，結果表 明，二孢擬奧德蘑在PH5. 0-8. 5都能生長，且差異顯著性測驗結果表明，各pH值對菌絲生長 速度的影響差異不顯著（圖5);從生長勢來看，不同pH值下菌落生長都很旺盛（圖6)。由 此可知，二孢擬奧德蘑菌絲生長對酸堿環境無嚴格要求。
[0050] 綜合以上結果，二孢擬奧德蘑菌絲生長的最適碳源為麥芽糖，適合的氮源為酵母 膏和牛肉膏，最適培養溫度為28 °C，對酸堿環境無嚴格要求。
[0051] 四、菌株的鑒定
[0052] 所得菌株的基因組DNA經過通用引物ITS4和ITS5進行PCR擴增，獲得大小為 722bp的特異性DNA片斷，序列信息參見序列表SEQ ID NO. 1。
[0053] 根據以上鑒定結果，所得的菌株命名為二孢擬奧德蘑Hymenop