一種高產胞外黃色素的紅曲霉菌株及其選育方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物菌種選育的技術領域，特別涉及一種高產胞外黃色素的紅曲霉菌株及其選育方法與應用
【背景技術】
[0002]紅曲霉菌，作為一種絲狀真菌，屬于真菌界、子囊菌門、子囊菌綱、散囊菌目、紅曲科。紅曲色素是由紅曲霉菌次級代謝產生的一系列聚酮類化合物的天然色素，在中國、韓國和日本一直被作為食品添加劑廣泛用于飲料、醬、食用油、面包、糕點等領域，已有上千年歷史。目前商品用紅曲色素一般為混合色素，主要分為紅、橙、黃三大類。由于紅曲霉液態發酵的紅曲色素主要是胞內色素，這些色素易溶于乙醇、丙酮等極性較大的有機溶液，都是非水溶性的色素，因此在食品應用方面受到一定的限制。
[0003]近年來，除了作為食用著色劑以外，有研究報道兩種紅曲黃色素，包括紅曲素(monascin)和安卡紅曲黃素(ankaflavin)，是降脂的有效成分，能顯著降低血清TC、TG、低密度脂蛋白和膽固醇的水平；紅曲黃色素monaphilone A和monaphilone B對人體喉癌細胞株(HEp-2)、人結腸癌細胞株(WiDr)有抗增殖作用，且在一定劑量下(70uM)對人肺部成纖維細胞系無明顯毒性(J Agric Food Chem，2010，58(14):8211-8216.)，應用市場巨大。但目前紅曲黃色素絕大部分都是胞內脂溶性黃色素，生產工藝較復雜，且不利于在水溶性場合使用。生產中通常采用化學轉化方法，改變其結構及發色性能成為水溶性色素，但是嚴格來說，轉化后成為非天然色素，其使用受到了一定的質疑和限制。故選育一種高產胞外黃色素的紅曲霉菌株對天然胞外紅曲黃色素的生產及應用具有直接現實的重要意義和價值。
[0004]微生物對生存條件變化的適應能力是菌株選育的很好途徑，外界環境的變化，能使微生物群體特性發生相應的變異。紫外誘變是傳統的微生物菌種選育方法，其主要生物學效應是由于DNA變化而造成的，DNA對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更敏感。紫外線引起DNA結構變化，使得DNA鏈的斷裂、堿基破壞，最主要的作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。紫外線的波長一般在200-380nm之間，但最有效的誘變波長是252_265nm，通過對紅曲生產菌株的紫外誘變，改變生產菌株的生理性狀，從而篩選高產紅曲胞外黃色素的生產菌株，是一種篩選改良菌種有效的技術手段。
【發明內容】
[0005]本發明的首要目的在于克服現在菌種的缺點與不足，提供一種高產胞外黃色素的紅曲霉菌株。
[0006]本發明的另一目的在于提供所述高產胞外黃色素的紅曲霉菌株的選育方法。
[0007]本發明的再一目的在于提供所述高產胞外黃色素的紅曲霉菌株的應用。
[0008]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種高產胞外黃色素的紅曲霉菌株，名稱為紅色紅曲霉(Monascus ruber) WQ15，保藏編號為CGMCC N0.10910，于2015年7月2日保藏于位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0009]所述高產胞外黃色素的紅曲霉菌株的形態如下:在PDA平板上培養7天，菌落形態較大，直徑30.8?31.8mm，菌落呈黃褐色，背面呈橙黃色；菌落邊緣完整，圓潤；中心凸起成丘陵狀，無輻射裂紋，有白色絨毛狀氣生菌絲生長；周圍光滑發亮，無油滴狀物質；菌絲光滑，透明無色，有隔；分生孢子呈球形或倒梨，單生或成鏈；閉囊殼較大，球形，囊內孢子可見，橢圓形。
[0010]所述高產胞外黃色素的紅曲霉菌株的選育方法，包含以下步驟:
[0011](I)孢子懸浮液制備:出發菌株接種于PDA培養基斜面上，在28?30°C培養2?3d后，用生理鹽水沖洗菌種斜面，經玻璃珠打散，去除菌絲，得到含有孢子的懸浮液；
[0012](2)紫外誘變:將步驟⑴得到的含有孢子的懸浮液置于平底培養皿中，在15W紫外燈垂直距離下30cm放置，同時磁力攪拌照射一定時間，進行紫外誘變；
[0013](3)平板分離篩選:接著將步驟⑵誘變后的懸浮液稀釋后涂布于PDA平板，28?30°C恒溫避光倒置培養，待長出菌落后，挑選出菌落形態發生變化的菌株，進行單菌落劃線分離，經反復分離純化得到較純的誘變菌株；
[0014](4)發酵選育:
[0015]①種子液的制備:將步驟(3)純化后得到的誘變菌株接種于滅菌的種子培養基中進行培養增殖，每50mL種子培養基接種3?5個培養4_7天的單菌落，150?200rpm培養28?32h，使種子培養基有成熟的孢子，得到種子液；
[0016]②發酵培養及高糖純化:將種子液按8%接種量(V/V)接種到25mL發酵培養基中，發酵培養2?4天，然后加入葡萄糖直至糖濃度達到300g/L以上，再培養直至10?16天，離心、抽濾，得到含胞外紅曲色素的上清液，檢測胞外色素的色價和色調，得到高產胞外黃色素的紅曲霉菌株。
[0017]步驟(I)中所述的去除菌絲優選為通過4層無菌擦鏡紙濾去菌絲。
[0018]步驟⑴中所述的含有孢子的懸浮液中孢子的濃度優選為I X 15個/mL。
[0019]步驟(I)中所述的出發菌株優選為紅曲霉菌株Monascus ruber GIM3.240。
[0020]步驟(3)中所述的菌落形態包括菌落大小、顏色和氣生菌絲等。
[0021]步驟(3)中所述的純化的操作如下:將菌落劃線于PDA平板上培養，直至從同一菌落上劃出來得到的菌落形態類似。
[0022]所述的PDA培養基的組成為:馬鈴薯浸粉0.06g，葡萄糖0.4g，瓊脂粉0.3g，用蒸饋水定容至20mL，pH自然。
[0023]步驟(4)中所述的種子培養基的組成為:葡萄糖lg，酵母浸粉0.15g，魚粉蛋白胨0.5g，KCl 0.025g，KH2PO40.2g，FeSO4.7H20 0.5mg，用蒸餾水定容至 50mL，pH 自然。
[0024]步驟⑷中所述的發酵培養基的組成為:葡萄糖1.25g，(NH4) 2S040.125g，KH2PO40.125g，MgSO4.7H20 0.0125g，KCl 0.0125g，FeSO4.7H20 0.25mg，ZnSO4.7H200.25mg，MnSO4.H2O 0.75mg，用蒸饋水定容至 25mL，pH 自然。
[0025]所述高產胞外黃色素的紅曲霉菌株特別適合用于生產紅曲黃色素。
[0026]所述高產胞外黃色素的紅曲霉菌株用于生產紅曲黃色素，優選包括如下步驟:
[0027]1、將所述高產胞外黃色素的紅曲霉菌株接種于發酵培養基中，進行好氧發酵，使得紅曲霉菌處于對數生長期或穩定期；
[0028]I1、接著補加碳源，該碳源在發酵培養基中的濃度為至少60g/L，繼續好氧發酵；
[0029]II1、將發酵好的發酵液進行固液分離，取液體，得到胞外水溶性紅曲黃色素。
[0030]步驟(I)中所述的基本發酵培養基的組成如下??每10mL基本發酵培養基中，含葡萄糖 5g、(NH4)2SO40.5g、KH2PO40.5g、KCl 0.05g、MgSO4.7Η200.05g、FeSO4.7H20 1.0mg、ZnSO4.7H20 1.0mg、MnSO4.H2O 3.0mg，用蒸餾水定容至 100ml，pH 自然。
[0031]步驟(I)中所述的紅曲霉菌株在接種于發酵培養基時，優選為將紅曲霉菌進行活化、擴大培養后再接種入發酵培養基中。
[0032]所述的活化為常規的手段，如將紅曲霉菌種劃線于平板中進行培養。
[0033]所述的擴大培養為常規的手段，具體操作如下:從活化好的紅曲霉菌從平板上接種于種子培養基中進行培養增殖，每50mL種子培養基接種3?5個培養4_7天的單菌落、27?34°C、150?250rpm培養24?32h，使種子培養基有成熟的孢子，得到種子液。