用于檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白、制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及用于檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體的融 合蛋白、制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 產腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia Coli，ETEC)系人和幼畜 (初生仔豬、犢牛、羔羊及斷奶仔豬）腹瀉最常見的病原性大腸桿菌，其致病力主要由黏附 素性菌毛和腸毒素兩種毒力因子構成，二者密切相關且缺一不可。ETEC首先通過特異性粘 附素吸附到小腸粘膜上皮細胞表面的受體上，并定植于腸表面。初生幼畜被ETEC感染后因 劇烈水樣腹瀉和迅速脫水死亡，發病率、死亡率高。據統計，國內幼畜ETEC性腹瀉病在幼畜 腹瀉病中所占比例為：豬35 %，牛26 %，羊17 %，尤其是一周以內的新生幼畜。
[0003] 豬產腸毒素性大腸桿菌的黏附素抗原主要有F4 (K88)、F5 (K99)、F6 (987P)、 F7 (F41)和F18,其中以F4的流行最為普遍，因而也尤為重要。F4菌毛是我國仔豬腹瀉病原 黏附素的優勢抗原，主要引發新生仔豬、吸乳仔豬，甚至斷奶仔豬發生腹瀉。F5引發的仔豬 腹瀉僅次于F4。
[0004] 黏附素抗原具有良好的免疫原性，用帶有黏附素的菌體或純化的黏附素抗原免疫 動物體均可以產生高效價的特異性抗體。因此，抗黏附素抗體的檢測已成為診斷ETEC的重 要指標。目前，對ETEC致病因子的血清學檢測方法有凝集試驗、瓊脂擴散試驗和反向間接 血凝抑制試驗等，但這些方法耗時、費力、靈敏性差、特異性不高。熒光抗體技術雖然有較好 的特異性和敏感性，但比較主觀且不適合大規模樣品檢測；ELISA方法具有敏感性好、特異 性強、易操作等優點。以往多采用菌體作為包被抗原，雖成本低廉，但純度和產量較低，且特 異性差，易產生交叉反應；有研究者用純化的黏附性菌毛作為包被抗原，特異性較好，但黏 附素純化方法較繁瑣。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供用于檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白，可以用 于同時檢測抗F4和F5型豬產腸毒素性大腸桿菌抗體，有利于更加全面的監測豬群ETEC感 染和疫苗誘導的抗體水平。
[0006] 本發明的另一目的是提供所述融合蛋白的制備方法，該方法可以實現所述融合蛋 白可溶性表達，且該融合蛋白免疫反應性良好，產量較高。
[0007] 本發明的再一目的是提供所述融合蛋白在制備檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗 體的ELISA試劑盒方面的應用。該試劑盒檢測準確、操作簡便，特異性、敏感性、重復性均良 好，適合于在臨床應用中進行推廣，為ETEC的快速檢測提供了可靠手段。
[0008] 本發明的目的采用如下技術方案實現。
[0009] -種用于檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 本發明提供所述融合蛋白的編碼基因。
[0011] 優選的技術方案中，所述編碼基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 本發明提供含有所述基因的表達盒、載體或細胞。
[0013] 本發明還提供制備所述融合蛋白的方法，包括如下步驟：將所述融合蛋白的編碼 基因插入pCold I質粒，得到重組載體；將所述重組載體轉化宿主細胞，獲得陽性重組菌； 誘導所述陽性重組菌表達融合蛋白，純化后得到所述融合蛋白。
[0014] 優選的技術方案中，所述編碼基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015] 最后，本發明提供所述融合蛋白在制備檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體中的 ELISA試劑盒中的應用以及檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體的ELISA試劑盒，所述試劑 盒包括采用所述融合蛋白包被的ELISA板條。
[0016] 有益效果：本發明用于檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體的融合蛋白，可以用于 同時檢測抗F4型以及F5型豬產腸毒素性大腸桿菌的抗體，有利于更加全面的監測豬群 ETEC感染和疫苗誘導的抗體水平。本發明所述融合蛋白的制備方法，可以實現所述融合蛋 白可溶性表達，且該融合蛋白免疫反應性良好，產量較高。本發明所述融合蛋白可以應用于 制備檢測抗豬產腸毒素性大腸桿菌抗體的ELISA試劑盒。該試劑盒檢測準確、操作簡便，特 異性、敏感性、重復性均良好，成本較低，適合于在臨床應用中進行推廣，為ETEC的快速檢 測提供了可靠手段。
【附圖說明】
[0017] 圖 1 是 p Cold I-F4-F5 酶切鑒定電泳圖，其中 Ml :DL-2000，M2 :DL-15000,1-3 :重 組質粒pCold I-F4-F5的EcoR I和Sail酶切產物。
[0018] 圖2 :pCold I-F4-F5/BL21重組菌蛋白表達的SDS-PAGE分析，其中M :中分子量蛋 白質標準，1 :誘導后重組菌全菌蛋白；2 :誘導后重組菌裂解液上清；3 :包涵體重懸液。
[0019] 圖3 :pGEX-4T-1-F4-F5/BL21重組菌SDS-PAGE分析，其中M :中分子量蛋白質標 準，1和3 :包涵體沉淀，2和4 :誘導后重組菌裂解液上清。
[0020] 圖4是融合蛋白F4-F5的Western blot分析，其中M :中分子量蛋白質標準；1 :融 合蛋白F4-F5與F4陽性血清的免疫印跡；2 :融合蛋白F4-F5與F5陽性血清的免疫印跡。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0022] 實施例1制備用于檢測抗ETEC抗體的融合蛋白
[0023] 1、設計用于檢測抗ETEC抗體的融合基因
[0024] 通過生物學軟件DNAStar分析ETEC F4 (K88)菌毛和ETEC F5 (K99)菌毛的核苷酸 和氨基酸序列。運用密碼子優化軟件CodonAdaptationTool (JCAT)分析后，替換F4和F5 菌毛核苷酸序列中大腸桿菌的稀有密碼子為偏愛密碼子，并在F4和F5菌毛的基因片段之 間添加 linker序列，設計得到了融合基因，序列如SEQ ID N0:2所示。在融合基因的5'端 添加 EcoR I酶切位點，在3'端添加 Sal I酶切位點，送南京金斯瑞生物技術公司合成。
[0025] 融合基因編碼用于檢測抗ETEC抗體的融合蛋白F4-F5。融合蛋白F4-F5的氨基酸 序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0026] 2、融合蛋白F4-F5表達載體的構建
[0027] 將合成的融合基因片段與pCold I載體（TaKaRa)分別使用EcoR I和Sal I雙酶 切，然后混合，于37°C孵育3h。連接產物轉化Trans5 α感受態細胞（TaKaRa)，并涂布至含 氨芐青霉素抗性（100 μ g/ml)的LB平板，37°C培養過夜。挑取單克隆，于含氨芐青霉素抗 性的LB培養基中振蕩培養IOh后，提取質粒，酶切鑒定結果如圖1所示，證實融合基因片段 成功插入載體。將該陽性重組質粒命名為pCold I-F4-F5。
[0028] 另外，將融合基因片段分別插入常用原核表達載體pET28a、pGEX-4T_l和pET22b， 經酶切鑒定后分別得到陽性重組質粒pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5和pET22b-F4-F5。
[0029] 3、重組表達質粒的誘導表達
[0030] 重組質粒pCold I-F4-F5轉化BL21感受態細胞（TaKaRa)，挑取陽性克隆，提取菌 體質粒酶切鑒定。將陽性重組菌命名為pCold I-F4-F5/BL21。
[0031] pCold I-F4-F5/BL21活化培養至OD6。。達到1. 2,取Iml菌液保存，其余菌液中 加入終濃度為ImM的IPTG進行誘導。誘導后每隔3h取Iml菌液，至誘導后12h。將收集 到的菌液4°C、12000r/min離心5min收集沉淀。每管沉淀用80 μ L的PBS緩沖液懸起后 加入20 μ L SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴10min，用SDS-PAGE電泳分析。電泳結果如圖 2所示，參照分子質量標準，可見誘導表達獲得蛋白大小約為29kD，與融合蛋白F4-F5加 his-tag(GEhealthcare)大小一致，證明該重組質粒在大腸桿菌中得到了表達。
[0032] 取 ImL 誘導 12h 的 pCold I-F4-F5/BL21 菌液，12000rpm 離心 2min，用 300 yL PBS 緩沖液重懸菌體。凍融3次，超聲破碎，離心分離上清液與沉淀。用300 μ L PBS緩沖液重 懸包涵體沉淀。各取40 μ L菌體裂解液上清與包涵體重懸液，加入10 μ L SDS-PAGE上樣緩 沖液，沸水浴l〇min，進行SDS-PAGE電泳。電泳結果如圖2所示，可見融合蛋白F4-F5主要 在上清中表達，表達量占菌體總蛋白的35%左右。
[0033] 另外，將重組質粒 pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5 和 pET22b-F4-F5 分別按照常 規方法轉入感受態細胞BL21，分析各重組菌的蛋白表達情況。以pET28a和pET22b為表達 載體時，目標蛋白沒有獲得表達。以PGEX-4T-1為表達載體，目標蛋白以包涵體形式表達， 分子量約為56kD，如圖3所不。
[0034] 4、融合蛋白 F4-F5 的 Western Blot 實驗
[0035] 取誘導后12h的p