改良的抗血清清蛋白結合變體的制作方法
【專利說明】改良的抗血清清蛋白結合變體
[0001] 本申請是申請日為2010年2月17日、中國申請號為201080017229. 6、發明名稱為 "改良的抗血清清蛋白結合變體"的發明申請的分案申請。
[0002] 本發明涉及抗血清清蛋白免疫球蛋白單一可變域D0M7h_14的改良變體，以及包 含此類變體的配體和藥物偶聯物、組合物、核酸、載體和宿主。
[0003] 發明背景
[0004] W004003019和W02008/096158披露了抗血清清蛋白（SA)結合模塊，諸如抗SA免 疫球蛋白單一可變域（dAb)，它們具有治療上有用的半衰期。這些文件披露了單體抗SA dAb 以及包含此類dAb的多特異性配體，例如包含抗SA dAb和特異性結合靶抗原諸如TNFRl的 dAb的配體。披露了特異性結合來自超過一種物種的血清清蛋白的結合模塊，例如人/小鼠 交叉反應性抗SA dAb。
[0005] W005118642和W02006/059106披露了偶聯或聯合抗SA結合模塊，諸如抗SA免疫 球蛋白單一可變域至藥物以延長藥物半衰期的概念。披露和例示了蛋白質、肽和NCE (新化 學實體）藥物。W02006/059106披露了使用這種概念來延長促胰島素劑例如腸降血糖素激 素諸如胰高血糖素樣肽（GLP)-I的半衰期。
[0006] 還可參考Holt et al, "Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs'，，Protein Engineering, Design&Selection, vol 21，no 5，pp283-288,2008。
[0007] W02008/096158披露了 D0M7h-14,它是一種優秀的抗SA dAb。會希望提供作為 D0M7h-14變體的且特異性結合血清清蛋白（優選來自人和非人物種的清蛋白）的改良 dAb，這會提供在疾病的動物模型中以及對于人治療和/或診斷的效用。還會希望提供介于 相對適度和高親和力抗SA結合模塊（dAb)之間的選擇。此類模塊可連接至藥物，抗SA結 合模塊根據設想的目的應用來選擇。這會容許更好地剪裁藥物來治療和/或預防慢性或急 性適應證，取決于抗SA結合模塊的選擇。還會希望提供在溶液中是單體或基本上這樣的抗 dAb。這在抗SA dAb連接至結合模塊例如特異性結合細胞表面受體諸如TNFRl的dAb (其目 的是拮抗該受體）時會是尤其有利的。抗SA dAb的單體狀態在減少受體交聯的機會方面是 有用的，因為不太可能形成多聚體，多聚體能結合并交聯細胞表面上的受體（例如TNFR1)， 如此增加受體激動和有害受體信號傳導的可能性。
[0008] 發明概述
[0009] 本發明的各方面解決了這些問題。
[0010] 為此目的，本發明人令人驚訝地發現有益突變可靶向相對于D0M7h-14而言的 ⑶R3區92至96 (位置編號方式依照Kabat)。
[0011] 因此，在一個方面，本發明提供D0M7h_14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白單一可 變域變體，其中所述變體與D0M7h-14相比包含⑶R3區92至96 (位置編號方式依照Kabat) 中的至少一處突變，且其中所述變體與D0M7h-14的氨基酸序列相比具有1至8處變化。還 提供抗血清清蛋白（SA)結合模塊，其包含本發明這個方面的變體的CDR3。
[0012] 本發明的另一個方面提供D0M7h_14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白單一可變域 變體，其中所述變體與D0M7h-14相比包含位置22處的Ser和位置42處的Glu (編號方式 依照Kabat)，且其中所述變體與D0M7h-14的氨基酸序列相比具有O至4處別的變化。
[0013] 本發明任何方面的各實施方案提供具有優秀抗血清清蛋白親和力的D0M7h_14變 體。變體的選擇能容許根據期望的治療和/或預防背景來剪裁半衰期。例如，在一個實施方 案中，變體對血清清蛋白的親和力相對較高，使得變體對于包括在用于治療和/或預防慢 性或持久疾病、狀況、毒性或其它慢性適應證的產物中會是有用的。在一個實施方案中，變 體對血清清蛋白的親和力相對適度，使得變體對于包括在用于治療和/或預防急性疾病、 狀況、毒性或其它急性適應證的產物中會是有用的。在一個實施方案中，變體對血清清蛋白 的親和力是中等的，使得變體對于包括在用于治療和/或預防急性或慢性疾病、狀況、毒性 或其它急性或慢性適應證的產物中會是有用的。
[0014] 能想到對血清清蛋白具有適宜高親和力和特異性的分子會在循環中停留足夠久 來具有期望治療效果（Tomlinson, Nature Biotechnology 22,521-522(2004))。在此，高 親和力抗SA變體在血清循環中的停留會匹配物種的血清清蛋白（W02008096158)。一旦在 循環中，任何融合至AlbudAb?變體（AlbudAb是抗血清清蛋白dAb或免疫球蛋白單一可變 域）的治療劑（它是NCE、肽或蛋白質）因此會能夠對其靶物作用更久并展現更持久的治療 效果。這會容許靶向慢性或持久病，無需頻繁服藥。
[0015] 具有適度親和力（但是對SA的特異性）的變體只會在血清循環中停留較短時間 (例如幾小時或幾天），容許融合的治療劑特異性靶向急性病中涉及的治療靶。
[0016] 這樣有可能通過選擇具有適宜清蛋白結合親和力和/或血清半衰期的抗SA變體 來剪裁含有抗SA的產物適應治療疾病領域。
[0017] 本發明的一個方面提供多特異性配體，其包含任何上文所述抗SA變體和特異性 結合SA以外的靶抗原的結合模塊。
[0018] 本發明的一個方面提供融合產物，例如與肽或NCE (新化學實體）藥物的融合蛋白 或融合物，其包含融合或偶聯（對于NCE)至任何上文所述變體的多肽、蛋白質、肽或NCE藥 物，其中所述變體是D0M7h-14-10 (或具有與D0M7h-14-10的氨基酸序列至少95、96、97、98 或99%相同的氨基酸序列的變體）。D0M7h-14-10在融合或偶聯至配偶時只給出親和力的 適度下降，使得它在融合產物中有用。
[0019] 本發明的一個方面提供組合物，其包含任何前述方面的變體、融合蛋白或配體和 藥學可接受稀釋劑、載體、賦形劑或媒介。
[0020] 本發明的一個方面提供在患者中治療或預防疾病或病癥的方法，包括將至少一劑 依照本發明任何方面或實施方案的變體施用于所述患者。
[0021] 本發明的一個方面提供多肽融合物或偶聯物，其包含本文所公開抗血清清蛋 白dAb (例如D0M7h-14-10)和腸降血糖素或促胰島素劑，例如毒蜥肽-4、GLP-I (7-37)、 GLP-I (6-36)或W006/059106中披露的任何腸降血糖素或促胰島素劑，這些藥劑通過述及 而明確收入本文就像在本文中寫明包括在本發明和所附權利要求中。
[0022] 具體地，本發明涉及以下方面：
[0023] I. D0M7h-14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白單一可變域變體（D0M7h-14如圖1 所示），其中所述變體與D0M7h-14相比包含⑶R3區92至96 (位置編號方式依照Kabat)中 的至少一處突變，且其中所述變體與D0M7h-14的氨基酸序列相比具有1至8處變化。
[0024] 2.項1的變體，其中所述變體包含AQG(Xl) (X2) (X3)P(X4)T基序，其中A在位置 89(依照Kabat)，且（Xl)至（X4)中至少一個代表與D0M7h-14的序列相比的氨基酸變化。
[0025] 3.項1或2的變體，其中所述變體與D0M7h-14相比包含位置92、93和94中每一 處和任選位置96 (編號方式依照Kabat)處的突變。
[0026] 4.項3的變體，其中所述變體包含一或多個選自下述的氨基酸殘基
[0027] 位置 92 = L 或 F，
[0028] 位置 93 = R、M 或 K，
[0029] 位置94 = H或K，和
[0030] 位置96 = K或M (編號方式依照Kabat)。
[0031] 5.項1或2的變體，所述變體與D0M7h_14相比包含位置96處的Lys或Met (編號 方式依照Kabat)。
[0032] 6.項5的變體，其中所述變體包含一或多個選自下述的氨基酸殘基
[0033] 位置 92 = L 或 F，
[0034] 位置 93 = R、M 或 K，和
[0035] 位置94 = H或K (編號方式依照Kabat)。
[0036] 7.項1的變體，其中所述變體包含與選自D0M7h-14-10 (SEQ ID NO: 1)、 D0M7h-14-18(SEQ ID N0:2)、D0M7h-14-28(SEQ ID N0:4)和D0M7h-14-36(SEQ ID N0:5)的 單一可變域的氨基酸序列相同或與所選氨基酸序列相比具有多至4處變化的氨基酸序列， 其中所述變體與D0M7h-14相比包含⑶R3區92至96 (位置編號方式依照Kabat)中的至少 一處突變。
[0037] 8.抗血清清蛋白（SA)結合模塊，其包含任何前述項的所選變體的⑶R3。
[0038] 9.項8的結合模塊，其包含所選變體的⑶Rl或與所選變體的⑶Rl至少50 %相同 的氨基酸序列。
[0039] 10.項8或9的結合模塊，其包含所選變體的⑶R2或與所選變體的⑶R2至少50 % 相同的氨基酸序列。
[0040] 11. D0M7h-14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白單一可變域變體，其中所述變體與 D0M7h-14相比包含位置22處的Ser和位置42處的Glu (編號方式依照Kabat)，且其中所 述變體與D0M7h-14的氨基酸序列相比具有0至4處別的變化。
[0041] 12.項11的變體，其中所述變體包含與D0M7h-14-19(SEQ ID N0:3)的氨基酸序列 相同或與D0M7h-14-19的氨基酸序列相比具有多至4處變化的氨基酸序列，其中所述變體 與D0M7h-14相比包含位置22處的Ser和位置42處的Glu (編號方式依照Kabat)。
[0042] 13.前述項任一項的變體或結合模塊，其中所述變體或結合模塊包含以約0. 1至 約ΙΟΟΟΟηΜ、任選約1至約6000nM的解離常數（Kd)特異性結合人SA的結合位點，如通過表 面等離振子共振測定的。
[0043] 14.前述項任一項的變體或結合模塊，其中所述變體或結合模塊包含以約I. 5x 10 4至約0.1 sec \任選約3x 10 4至約0.1 sec 1的解離速率常數（K d)特異性結合人SA的 結合位點，如通過表面等離振子共振測定的。
[0044] 15.前述項任一項的變體或結合模塊，其中所述變體或結合模塊包含以約2xl06至 約lx IO4M 1Sec \任選約lx IO6至約2x IO4M 1Sec 1的結合速率常數（Ka)特異性結合人SA 的結合位點，如通過表面等離振子共振測定的。
[0045] 16.前述項任一項的變體或結合模塊，其中所述變體或結合模塊包含以約0. 1至 約ΙΟΟΟΟηΜ、任選約1至約6000nM的解離常數（Kd)特異性結合獼猴SA的結合位點，如通過 表面等離振子共振測定的。
[0046] 17.前述項任一項的變體或結合模塊，其中所述變體或結合模塊包含以約1.5x 10 4至約0.1 sec \任選約3x 10 4至約0.1 sec 1的解離速率常數（K d)特異性結合獼猴SA 的結合位點，如通過表面等離振子共振測定的。
[0047] 18.前述項任一項的變體或結合模塊，其中所述變體或結合模塊包含以約2xl06至 約lx IO4M 1Sec \任選約lx IO6至約5x 10 3M 1Sec 1的結合速率常數（K J特異性結合獼猴 SA的結合位點，如通過表面等離振子共振測定的。
[0048] 19. 一種多特異性配體，其包含前述項任一項的抗SA變體或結合模塊和特異性結 合除SA以外的靶抗原的結合模塊。
[0049] 20.項1至18任一項的抗SA變體單一可變域或模塊，其中所述可變域或模塊偶聯 至藥物（任選NCE藥物），任選其中所述可變域或模塊是D0M7h-14-10(SEQ ID N0:1)。
[0050] 21. -種融合蛋白，包含與依照項1至18任一項的變體或模塊融合的多肽或肽藥 物，任選其中所述變體或模塊是D0M7h-14-10(SEQ ID N0:1)。
[0051] 22. -種組合物，其包含前述項任一項的變體、模塊、融合蛋白或配體和藥學可接 受稀釋劑、載體、賦形劑或媒介。
[0052] 23. -種核酸，其包含編碼項1至18任一項的變體或模塊或項20的多特異性配體 或項21的融合蛋白的核苷酸序列。
[0053] 24. -種核酸，其包含D0M7h_14變體的核苷酸序列，所述序列選自核苷酸序列 D0M7h-14-10(SEQ ID N0:l)、D0M7h-14-18(SEQ ID N0:2)、D0M7h-14-28(SEQ ID N0:4)、 D0M7h-14-36(SEQ ID N0:5)或 D0M7h-14-19(SEQ ID N0:3)或與所述選定序列至少 80%相 同的核苷酸序列。
[0054] 25. -種載體，其包含項23或24的核酸。
[0055] 26. -種分離的宿主細胞，其包含項25的載體。
[0056] 27. -種在患者中治療或預防疾病或病癥的方法，包括將至少一劑項1至18任一 項的變體或模塊施用于所述患者。
[0057] 附圖簡述
[0058] 圖I :D0M7h-14變體dAb的氨基酸序列比對。特定位置處的"指示與在D0M7h-14 中在該位置處找到的氨基酸相同的氨基酸。CDR以下劃線和粗體文本指示（第一段標有 下劃線的序列是CDR1，第二段標有下劃線的序列是CDR2,而第三段標有下劃線的序列是 CDR3)〇
[0059] 圖2 :D0M7h_14變體的動力學參數。Kd單位=nM ;K d單位=sec a單位= M1Sec1c3記數法Ae-B表示A x 10 8而CeD表示C x IOd。指示了多種物種中的總體動力學 范圍，如得到下文例子支持的。還提供了供特定治療背景（急性或慢性適應證、狀況或疾病 和供慢性和急性背景二者使用的"中等"）使用的任選范圍。高親和力dAb和包