針對乙肝表面蛋白的雙特異性抗體及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明公開了抗乙肝表面蛋白雙特異性抗 體制備技術及其在預防HBV感染和治療HBV相關肝細胞肝癌中的用途。
【背景技術】
[0002] 乙肝病毒Ofepatitis B virus，HBV)是雙鏈DNA病毒，人體被感染后易引起慢性 乙型肝炎，進而導致肝硬化和（或）肝癌。據統計近年來全球約有3.5億HBV感染者，每年 約有100萬~150萬人死于急性或慢性HBV感染導致的肝功能衰竭，肝硬化和（或）肝癌， 因而預防HBV感染成為世界公共健康問題[ 1]。肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC， 簡稱肝癌）與病毒性肝炎的關系密切，是病毒性肝炎所引起的最重要死亡原因之一，亦是 臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內是位居第三的腫瘤相關致死原因，每年新發 病例中我國占全球42. 5%，已成為我國第二位的腫瘤病因。
[0003] 研究表明，HBV感染相關HCC患者中，HBV DNA載量高者（>105copies/ml)的HCC 發生率達10. 1%，而HBV DNA載量低者（<104copies/ml)的HCC發生率僅為3. 8%，基線高 病毒載量與HCC發生率升高有關。高病毒載量（HBV DNA彡0. 7mEq/ml)時，HCC復發危險 比為5. 13,切口緣陽性的HCC復發危險比為2. 14。因此，對乙肝患者進行抗病毒治療，有助 于延緩疾病向HCC的進展。對HBV相關HCC患者進行抗病毒治療，可通過改善肝功能而提 高生存率。近年的研究顯示，高HBV DNA載量與高HCC復發率及預后不良有關。對HBV感 染相關HCC術后患者進行抗病毒治療可能是除肝移植以外的另一種治療選擇，該治療可通 過改善肝功能而提高生存率。
[0004] 目前針對HBV感染主要采用α -干擾素和核苷酸類似物等藥物抗病毒治療，但該 兩類藥物長期使用療效欠佳，易于導致病毒突變，給治療帶來極大困難[2]。
[0005] 相對于抗病毒感染的藥物，乙肝特異性的免疫球蛋白（HBIG)的抗病毒效果好很 多。給予病人乙肝特異性的免疫球蛋白（HBIG)治療已給被各國的學者廣泛關注。諸如， HBIG在乙肝來源的肝癌后肝移植后的研究已達到很好的效果。HBIG是一種高效價的多克 隆外源性抗體，其是從健康獻血員中篩選出來，經過生物濃縮工藝制成。當人體感染HBV 時被動地接受這種被動免疫制劑，可使機體能短期內迅速中和并清除血清中游離的乙肝病 毒，避免乙肝病毒定位感染。
[0006] 然而，當前HBIG作為治療性抗體的來源存在諸多非安全因素。同時，乙肝免疫球 蛋白成分復雜，危險因素相對不確定，生產方式受限，這些因素制約著乙肝治療性抗體的臨 床使用[3]。
[0007] 因此迫切需要研發一種安全有效及危險因素相對可控的生物制品替代人乙肝 免疫球蛋白，所以研發乙肝特異性人源基因工程抗體越來越受到關注。因單克隆抗體具 有特異性強、靈敏度高且易大規模生產等優點，故研發針對乙肝表面抗原（Hepatitis B surface Ag, HBsAg)的單克隆抗體，以期能夠安全有效地阻止HBV感染及其相關的肝炎、肝 硬化及肝癌的進程。
[0008] 由于疾病的多因素性，單一靶點治療往往不能滿足臨床的需求[4]。在臨床試驗中 已有聯合運用兩種單克隆臨床前實驗的報道 [5]，但這種聯合應用單克隆抗體的卻有很多限 制性[6]。例如，聯合應用兩種單克隆抗體的的安全性和效果需要分別去評價，由此產生的長 周期，高昂的開發費用限制其研制進程，而雙特異性抗體恰好解決了這一瓶頸 [7]。
【發明內容】
[0009] 本發明是為解決上述問題而進行的，提供了一種針對表面抗原蛋白的雙特異性抗 體A3B 5-BsAb,本發明采用了如下技術方案：
[0010] 本發明提供的針對乙肝表面蛋白的雙特異性抗體A3B5-BsAb,其特征在于，具有： 重鏈可變結構域，包含高變區OTR 1、⑶R2、⑶R3、⑶R4、⑶R5、⑶R 6;以及輕鏈可變結構域，包含 高變區⑶R1' XDR2'、⑶R3'、⑶R4'、⑶R5'、⑶R 6'，重鏈可變結構域的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 6所示，輕鏈可變結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0011] 其中，⑶札的氨基酸序列為：Met-Tyr-Ala-Phe-Ser ;Q)R 2的氨基酸序列為 le_I Ie-Pro-Ser-Phe-Asp-Thr-Thr-Asn-Tyr-Ala-Gln-Lys-Phe-Gln-Cys ;CDR3的氨基酸序 列為：Ser-Val-I Ie-Thr-Asp-Leu-Asp-Thr-Val-Gly-Asn-Asp-Glu-Ser-Gly-Asp-Ala-Ser-Tyr-Tyr-Tyr-Met-Asp-Val ;001?4的氨基酸序列為：Ser-Ser-Ala-Ile-Leu ;001?5的氨基酸序 列為：Trp-IIe-Val-Val-Gly-Ser-Gly-Asn-Ala-Lys-Tyr-Ala-Gln-Arg-Phe-Gln-Glu ;CDR6 的氨基酸序列為：Arg-Gly-His-Ser-Phe-Thr-Ser-Pro-Phe-Asp-Ser ;
[0012] CDR1'的氨基酸序列為：Arg-Ser-Ser-Glu-Ser-Leu-Gln-His-Ser-Asp-Gl y-Thr-Tyr-Tyr-Leu-Asp ;CDR2'的氨基酸序列為：Ser-Ala-Ser-Asn-Thr-Ala-Pro ; CDR/ 的氨基酸序列為：Met-Gln-Ala-Leu-Glu-Thr-Pro-Phe-Thr ;CDR / 的氨基酸序 列為：Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Gly-Ser-Asn-Tyr-Leu-Ala ;CDR5'的氨基酸序列為： Gly-Ala-Ser-Thr-Arg-Ala-Thr ;CDR6'的氨基酸序列為：Gln-Lys-Tyr-Gly-Ser-Ser-Leu-Thr0
[0013] 同時，雙特異性抗體A3B5-BsAb選自抗乙肝病毒表面抗原的雙特異性抗體以及所 述雙特異性抗體片段中的任意一種，該雙特異性抗體片段為所述雙特異性抗體的Fab片段 或F(ab'） 2片段。
[0014] 進一步的，本發明還提供了一種針對乙肝表面蛋白的抗體片段，該抗體片段為雙 特異性抗體A 3B5-BsAb的Fab片段或F (ab'）2片段。
[0015] 進一步的，本發明提供了一種編碼雙特異性抗體A3B5-BsAb的基因，編碼重鏈可變 結構域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，編碼輕鏈可變結構域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0016] 進一步的，本發明提供了一種含有至少一個拷貝的上述基因的表達載體。
[0017] 進一步的，本發明提供了一種含有至少一個上述的表達載體的宿主細胞。
[0018] 進一步的，本發明提供了雙特異性抗體A3B5-BsAb或其Fab片段或F(ab'） 2片段在 制備預防或治療乙肝病毒相關肝病的藥物或診斷試劑中的用途。所述藥物或診斷試劑除包 含抗體或抗體片段外，還包含可藥用賦形劑、稀釋劑與載體中的任意一種。
[0019] 發明作用與效果
[0020] 本發明提供了一種針對乙肝表面抗原蛋白的雙特異性抗體A3B5-BsAb,該雙特異性 抗體由抗體A3D5以及抗體B 5H6組合而成，但其中和HBV病毒的能力以及抑制HBsAg釋放的 能力較單純將抗體A3D5以及抗體B5H6聯合應用更優，顯現出較強的協同效果，進而可能阻止 HBV的感染相關的肝炎、肝硬化及肝癌的進程。同時，由于該抗體是從接種乙肝疫苗的志愿 者外周血中HBsAg特異的記憶性B細胞中克隆獲得的全人源抗體，其具有較鼠源、嵌合及人 源化抗體更低的免疫原性。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1是本發明的雙特異性抗體A3B5-BsAb特異性結合抗原圖；
[0022] 圖2是本發明的合成肽在乙肝表面抗原（HBsAg)的位置示意圖；
[0023] 圖3⑷是本發明的雙特異性抗體A3B5-BsAb結合抗原表位P 3的結果圖；
[0024] 圖3 (B)是本發明的雙特異性抗體A3B5-BsAb結合抗原表位P2的結果圖；
[0025] 圖4是本發明的雙特異性抗體A3B5-BsAb影響細胞中HBsAg表達的定量檢測結果 圖；
[0026] 圖5是本發明的雙特異性抗體A3B5-BsAb影響細胞中HBV DNA復制數的定量檢測 結果圖；
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