姚虻天然抗炎癥多肽cecropin-TY1及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提取自姚蛇唾液腺的天然抗炎癥多肽cecropin-??Ι及其在抗炎癥中的新應用，屬于生物醫學技術領域。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著傳統抗生素的濫用，微生物對傳統抗生素產生了越來越強的耐受性，微生物感染已成為嚴重威脅人類健康的難題。這些微生物中特別是革蘭氏陰性細菌感染時能釋放脂多糖(LPS)，會引發膿毒血癥和內毒素休克。一直以來對微生物感染引發的膿毒血癥的主要治療方法為輸液、改善機體供氧、抗感染治療和免疫治療等。同時這些治療方法又存在著諸多不足，比如抗感染治療會導致大量細菌被殺死而釋放出大量內毒素，加劇膿毒血癥。因此，這就需要持續開發新的治療膿毒血癥的制劑。
【發明內容】
[0003]為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種姚虻天然抗炎癥多肽cecropin-TYl 及其應用。
[0004]本發明的技術方案是:
[0005]Cecropin抗菌肽是一類具有抗菌功能的一種小分子多肽，其中一部分cecropin抗菌肽還具有抗炎的功能，而且能中和內毒素，即在抗菌的同時能中和細菌感染是所釋放的內毒素，并發揮抗炎功能。根據報道，有研究者基于宿主-體外寄生蟲相互作用的關系，對吸血昆蟲姚蛇(Tabanus yao)成功吸血機制進行研究，從姚蛇唾液腺中發現了 cecropin類多肽 cecropin-TYl。
[0006]本發明所述的姚虻天然抗炎癥多肽cecropin-TYl，提取自姚虻唾液腺，由39個氨基酸組成，碳末端酰胺化，分子量為3970.22道爾頓，等電點為11.17，其氨基酸序列為SEQID: 1，即 GlylTry2Leu3Lys4Lys5Ile6Gly7Lys8Lys9Ilei0GlullArgi2Vali3Glyi4Gln15Asn16Val17Arg18Asni9Ala2oAla2iIle22Ser23Thr24Ile25Pro26Ile27Ala28Gln29Gly3oAla3iAla32Gly33Val34Ala35Gly36Ala37Leu3SAsn39-NH2，且其中所有氨基酸均為L-型。
[0007]本發明所述的姚蛇天然抗炎癥多肽cecropin-??Ι在制備抗炎藥物、細菌感染引起的膿毒血癥和內毒素休克藥物、獸藥、動物飼料及化妝品中的應用。
[0008]其具體的為:
[0009]本發明所述的姚蛇天然抗炎癥多肽cecropin-TYl在抑制脂多糖誘導的巨■細胞產生一氧化氮中應用；在抑制脂多糖誘導的巨噬細胞產生炎癥細胞因子中的應用；在抑制脂多糖誘導的炎癥信號通路中的應用，包括在抑制脂多糖誘導的絲裂原活化蛋白激酶信號通路的激活中的應用，和在抑制脂多糖誘導的核轉錄因子NF-κΒ的激活中的應用；在中和內毒素功能中的應用。
[0010]借由上述方案，本發明至少具有以下優點:本發明中所述提取自姚虻唾液腺中的天然抗炎癥多肽cecropin-TYl具有分子量小、合成簡單、抗炎效果明顯、細胞毒性低的特點，在醫藥、化妝品和養殖業等領域具有廣泛的應用前景。
[0011]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明Cecropin-TYl抑制誘導型一氧化氮合酶的轉錄結果圖；
[0013]圖2是本發明Cecropin-TYl抑制亞硝酸鹽的產生的結果圖；
[0014]圖3是本發明Cecropin-TYl抑制炎癥細胞因子的產生的結果圖；
[0015]圖4是本發明Cecropin-TYl抑制MAPKs的激活的結果圖；
[0016]圖5是本發明cecropin-TYl抑制NF- κ B的激活的結果圖；
[0017]圖6是本發明cecropin-TYl對小鼠巨噬細胞的毒性；
[0018]圖7是本發明cecropin-TYl的內毒素中和活性；
[0019]圖8是本發明cecropin-TYl在不同溶液中的圓二色譜圖；
[0020]圖9是本發明cecropin-??Ι的溶液結構模擬示意圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖和具體實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述，以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0022]—、姚虻唾液免抗炎癥多肽cecropin-TYl對脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞一氧化氮(NO)產生的影響。
[0023](I)、抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的轉錄:
[0024]誘導型一氧化氮合酶(iNOS)是一氧化氮(NO)產生所必須的合成酶，首先檢測cecropin-TYl對一氧化氮合酶轉錄水平的影響。C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于24孔細胞培養板中(2.5 X 15細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養基(購買自美國Gbico公司)培養，待細胞貼壁后，如圖1標注所示，在細胞中加入100ng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia coli 0111:B4,購買自Sigma)，同時分別加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-??Ι，并分別設置多種對照組，包括:只加LPS組、只加多肽組(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl組。共孵育6小時后，收集細胞，用Trizol (購買自Takara)裂解細胞，提取RNA，用逆轉錄試劑盒(購買自Takara)合成cDNA，并用熒光定量PCR檢測不同處理的細胞中iNOS的轉錄水平。
[0025]由圖1可見，cecropin-TY以劑量依賴的方式抑制了 iNOS的轉錄。只加LPS處理的細胞的iNOS的轉錄水平設定為100%，而加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl處理后，iNOS 的轉錄水平分別只有 41.2%、31.3%和 15.8%, cecropin-TYl 減少了 58.8%、68.7%和84.2%的iNOS的轉錄。
[0026](2)、抑制亞硝酸鹽的產生:
[0027]細胞培養基中亞硝酸鹽(nitrite)的累積水平可以間接反映NO的產生，接著檢測了 cecropin-TYl對亞硝酸鹽產生的影響。將C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于24孔細胞培養板中(2.5 X 15細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養基(購買自美國Gbico公司)培養，待細胞貼壁后，如圖2標注所示，在細胞中加入lOOng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia coli 0111:B4，貝勾買自Sigma)，同時分別加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl，并分別設置多種對照組，包括:只加LPS組、只加多肽組(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl組。共孵育24小時后，收集培養上清，用格里斯試劑(購買自碧云天)檢測不同處理的細胞后細胞培養上清亞硝酸鹽的累積水平。
[0028]由圖2可見，cecropin-TY以劑量依賴的方式抑制了亞硝酸鹽的產生。只加LPS處理組亞硝酸鹽的累積水平為20.4 μ M，加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl處理后，亞硝酸鹽的累積水平分別只有12.0,7.3和5.0 μ M，cecropin-TYl減少了 40.0,63.7和75.0%的亞硝酸鹽的產生。
[0029]二、姚虻唾液抗炎癥肽cecropin-TYl對脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞炎癥細胞因子產生的影響。
[0030]將C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于24孔細胞培養板中(2.5X 15細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養基(購買自美國Gbico公司)培養，待細胞貼壁后，如圖3標注所示，在細胞中加入10ng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia col1lll:B4，購買自Sigma)，同時分別加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl，并分別設置多種對照組，包括:只加LPS組、只加多肽組(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl組。共孵育6小時后，收集細胞培養上清，用酶聯免疫試劑盒(購買自達科為)檢測細胞因子腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-1β (IL-Ιβ)和白介素-6(IL-6)的累積水平。同時收集細胞，用Trizol(購買自Takara)裂解細胞，提取RNA，用逆轉錄試劑盒(購買自Takara)合成cDNA，并用熒光定量PCR檢測不同處理的細胞中炎癥細胞因子TNF-a、IL-1 β和IL_6的轉錄水平。
[0031]如圖3所示，cecropin-TYl以劑量依賴的方式抑制了 LPS誘導的炎癥細胞因子TNF-α ,IL-1 β和IL-6的轉錄和產生。在濃度為20mg/mL時，cecropin-TYl抑制了 60.3%的 TNF-a、67.5% 的 IL-1 β 和 94.1 % 的 IL-6 的轉錄，同時，20mg/mL 的 cecropin-TYl 減少了 72.1%的 TNF-a、63.4%的 IL-1 β 和 76.2%的 IL-6 的產生。
[0032]三、Cecropin-TYl對炎癥信號通路的影響。
[0033]將C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞鋪于6孔細胞培養板中(I X 16細胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL硫酸鏈霉素的RMP1-1640培養基(購買自美國Gbico公司)培養，待細胞貼壁后，如圖4和圖5標注所示，在細胞中加入lOOng/mL脂多糖(LPS，來自于大腸桿菌Escherichia c