用于擴增干細胞的組合物和方法
【專利說明】用于擴増干細胞的組合物和方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本發明要求2013年1月30日提交的美國臨時專利申請號61/758, 541的優先權， 其整個內容通過引用并入本發明。
[0003] 關于聯邦資助研究的聲明
[0004] 本發明是在美國國立衛生研究院授予的基金號CA118085和CA098210的政府支持 下完成的。美國政府具有本發明的某些權利。 發明領域
[0005] 本申請涉及通過使用增強干細胞生長和增殖的、并且在擴增過程中維持細胞的干 性的多肽來擴增干細胞群的方法。本申請還涉及新型的同源異型盒蛋白突變體（例如， H0XA9和H0XB4突變蛋白）及其在擴增某些干細胞群上的用途。本申請還提供了用于治療 患有疾病或病癥的對象的方法，所述疾病或病癥需要以干細胞為基礎的治療。
[0006] 發曰月背景
[0007] 干細胞發育成幾種不同的細胞類型。首先，干細胞分為兩類：胚胎的和成體的。在 發育中的胚胎中，干細胞分化成特化的胚胎組織。在成體生物體中，干細胞和祖細胞作為該 機體的修復系統發揮作用，補充特化的細胞，并且還保持再生性的器官（例如血液、皮膚或 腸組織）的正常周轉。成體干細胞可以分化進入多種通路。間充質干細胞是產生多種細胞 類型（包括骨的細胞（骨細胞）、軟骨的細胞（軟骨細胞）、脂肪細胞（脂細胞）和結締組 織（即，肌腱））的成體干細胞。神經干細胞是腦中的成體干細胞，其產生三種主要的細胞 類型：神經元、星形膠質細胞和寡突膠質細胞。上皮干細胞是沿著消化道存在于深隱窩中的 成體干細胞。皮膚干細胞是存在于表皮的基底層和毛囊底部中的成體干細胞。
[0008] 造血干細胞（HSC)是多能的、非對稱性自我更新的細胞，其通過連續多輪的分化 產生所有成熟的血細胞。具體地，在經重組型人粒細胞集落刺激因子（G-CSF)處理后，已經 在胚胎骨髓、胚胎肝臟、臍帶血（UCB)、成體骨髓和外周血中鑒定出了HSC，所述HSC能夠分 化成三種細胞系，包括紅系骨髓（myeloerythroid)(即，紅血細胞、粒細胞、單核細胞）、巨 核細胞（即，血小板）和淋巴細胞（即，T細胞、B細胞和自然殺傷細胞）。在臨床移植操作 中使用這些HSC來治療多種疾病，包括惡性的和非惡性的病癥。目前，HSC的移植被用于治 療血液系統疾病，例如白血病和骨髓衰竭。通過HSC的擴增可以允許使用有限數量的樣品 (例如，臍帶血）或較低總數的HSC(例如，較少的HSC移動劑），這將改善移植預后并且有助 于滿足對干細胞移植的需求。然而，對HSC幾乎不能擴增，這很大程度上限制了目前對HSC 移植的應用，因此缺少用于治療患者的HSC。
[0009] 已經集中地研究了支配自我更新過程的信號，以通過瞬時增強增殖途徑或阻斷分 化信號來促進HSC的擴增，這些會是非常理想的增加用于移植的HSC數量的方式。人體研 究揭示，成體HSC可以在經歷重復多輪的不對稱性自我更新的同時，維持干細胞庫，但是幾 乎很少擴增或沒有擴增。與此相反，胚胎的和新生兒的干細胞可在培養物中維持2-3個 月，并伴有HSC數量的絕對升高。參見Ando, K. et al.，Blood. 2006 ;107 (8) : 3371-3377 ;和 Dahlberg,A.etal.，Blood. 2011 ;117 (23):6083_6090〇
[0010] 同源異型盒（HOX)基因編碼的轉錄因子在胚胎發育過程中調節模式的產生，并且 在出生前和出生后調節造血。正如與其3'至5'端染色體位置相關的轉錄順序所反映的，在 發育早期階段，H0X基因的表達受時間和空間上的調節。然而，H0X基因表達的時-空性調節 在造血中是觀察不到的，相反則是呈現出復雜的、重疊的非譜系特異性表達模式。某些H0X 基因在HSC和祖細胞中高表達，并且通常隨細胞最終分化成成熟的、譜系特異性的血細胞 而下調。參見Sauvageau，G et al.，Proc Natl Acad Sci US A.1994 ;91 (25):12223-12227〇 然而，迄今為止，在造血過程中HOX基因的轉錄調節機制大部分仍然是未知的。
[0011] 鑒定出在⑶34+HSC和早期祖細胞中高表達的H0X基因，這導致發現在細胞培養物 中和在骨髓移植之后，經由逆轉錄病毒轉導的H0XB4的表達促進鼠HSC的選擇性擴增。參 見Sauvageau，Getal.，GenesDev. 1995 ;9 (14): 1753-1765。此外，轉導有H0XB4 的HSC 的增殖的增強并沒有改變HSC的分化。參見Thorsteinsdottir,U.etal.，Blood. 1999 ; 94(8) : 2605-2612 ;和Antonchuk，J.etal.，Cell. 2002 ; 109(1) :39-45〇
[0012] 相反的，當其他HOX基因如H0XA9在HSC中組成性表達時，骨髓性白血病的情況 便會發生。參見Kroon,E.etal.，EmboJ. 1998 ;17 (13): 3714-3725 ;and;和Care,A.et al.，1999 ;18(11) : 1993-2001.。此外，當分析HOX蛋白的過表達在不同物種中的影響時， 觀察到H0X誘導的HSC增殖的幅度具有物種特異性的變化。具體地，與在小鼠和狗的細胞 中觀察到的相比，在來自人類和狒狒的細胞中觀察到的效應較為適中。參見Zhang,XBet al.，JClinInvest. 2008 ;118(4): 1502-1510.。另外的研究揭示，在移植了表達有逆轉錄 病毒轉導的H0XB4的HSC的兩年后，在大型哺乳動物中發生了骨髓性白血病，這突出了這種 基因操作的風險。參見Zhang,XB.，JClinInvest. 2008 ;118(4): 1502-1510。總的來說， 目前的研究表明，H0X的易位表達不太可能產生一種HSC擴增的方法，以能夠促使HSC增殖 達到產生治療顯著量的HSC所必需的水平。
[0013] 因此，為了潛在的人類治療的應用，有必要通過瞬時遞送方法放大H0X在HSC中 的表達水平。為此目的，相較于整合逆轉錄病毒，直接的蛋白轉導方法產生了與離體的鼠 HSC的增殖相當的水平，但是H0X蛋白較短的半衰期使得有必要頻繁補充所述重組蛋白，而 所述補充對于大規模離體擴增HSC是不切實際的。參見Krosl，J.etal.，NatMed. 2003 ; 9 (11) : 1428-1432。最近，有研究試圖通過修飾H0XB4蛋白天然肽的N-末端結構域來穩定 該蛋白。參見美國專利號8, 039, 463。然而，雖然在N-末端的突變導致了蛋白穩定性的提 升，但是這樣的突變體不能超越野生型H0XB4蛋白，因而長期再增殖的能力有所降低。
[0014] 發明概沐
[0015] -些H0X蛋白，包括H0XB4和H0XA9蛋白，易于通過⑶L4泛素連接酶進行泛素化 以及隨后的降解。本發明已經在H0X蛋白HD區的第一a螺旋內鑒定出了降解信號（降解 決定子）。具體地，所述降解決定子包括賴氨酸-谷氨酸-Xaa-谷氨酸（"LEXE基序"[SEQ IDN0:2])序列，其位于H0X蛋白HD區的第一a螺旋結構域內。本發明還已經確定，在所述 LEXE基序內的突變使得H0X蛋白的產生顯著的穩定性。因此，本發明提供了突變的H0X(或 者"H0X(m)"）蛋白及其在擴增干細胞中的用途。
[0016] 在某些實施方式中，所述HOX(m)蛋白是H0XB4 (m)蛋白。所述人H0XB4蛋白的所 述HD區由氨基酸163-221組成，所述LEXE基序位于第175-178位。在具體的實施方式中， 本發明所述H0XB4(m)蛋白包括在175、176、178位的至少一個上發生氨基酸替換（例如， 如SEQIDN0:3中所述所示）。在本發明的某些方面，H0XB4(m)蛋白在位于H0XB4多肽的 LEXE基序內的175、176、178位氨基酸中的至少兩個含有氨基酸突變，S卩，所述三個保守氨 基酸L175、E176和E178中的至少兩個發生突變（例如，替換）。在其他實施方式中，在所 述LEXE基序內，H0XB4 (m)蛋白在所有三個所述保守氨基酸上含有氨基酸替換。
[0017] 在其他實施方式中，所述HOX(m)蛋白是H0XA9 (m)蛋白。所述人H0XA9蛋白的所 述HD區由氨基酸207-263組成，所述LEXE基序位于第219-222位。在具體的實施方式中， 本發明所述H0XA9(m)蛋白包括在219、220、222位的至少一個上發生氨基酸替換（例如，如 SEQIDN0:6中所述所示）。在本發明的某些方面，H0XA9(m)蛋白在位于野生型H0XA9蛋白 的LEXE基序內的219、220、222位氨基酸中的至少兩個上含有氨基酸突變，S卩，所述三個保 守氨基酸L219、E220和E222中的至少兩個發生突變（例如，替換）。在其他實施方式中， H0XA9 (m)蛋白在位于LEXE基序內的所有三個所述保守氨基酸上含有氨基酸突變。
[0018] 本文所公開的HOX(m)蛋白具有獨特的特點。例如，本申請所述H0XB4和H0XA9突 變蛋白具有比其野生型H0X蛋白對應物更長的壽命，這是因為所述新型的突變蛋白包括在 所述野生型H0X蛋白同源結構域的降解決定子區（例如，LEXE基序）的突變，所述突變抑 制⑶L4泛素連接酶對所述H0X蛋白的翻譯后調節。具體地，本發明已經證實，所述H0XB4 或H0XA9蛋白的所述LEXE基序的突變阻止CUL4A泛素連接酶和所述H0XB4或H0XA9蛋白 同源結構域的第一a螺旋結構域之間的相互作用。因此，在所述LEXE基序上具有突變的 HOX(m)蛋白是抗降解的蛋白，并且比野生型H0X蛋白存在的時間更長。
[0019] 在其他實施方式中，基于向干細胞群提供擴增所述干細胞群有效量的HOX(m) 蛋白，本申請提供了用于擴增干細胞群的方法。在某些實施方式中，所述HOX(m)多肽是 H0XB4 (m)蛋白。在其他特定的實施方式中，所述HOX(m)多肽是H0XA9 (m)蛋白。
[0020] 本申請進一步提供了用于在需要以干細胞為基礎的治療的對象中治療疾病、病癥 或異常的方法。在一個非限制性實施方式中，所述治療方法包括將治療有效量的干細胞群 移植給需要該移植的對象，所述干細胞群已經在H0X(m)蛋白存在的條件下進行了擴增。
[0021] 附圖簡沐
[0022] 圖1?⑶L4A靶向H0XB4用于泛素依賴性降解。A?通過用抗MYC和肌動蛋白（上 樣對照）的抗體進行免疫印跡，確定在293T細胞中共轉染了遞增水平的MYC-CUL4A后得到 的MYC-H0XB4的穩態水平。B.在敲低shCUL4A之后，進行對H0XB4半衰期的脈沖追蹤分析。 C.在轉染了所示質粒、經MG132處理、在變性條件下用Ni2+-NTA瓊脂糖珠進行沉淀并用抗MYC抗體進行免疫印跡之后，在293T細胞中檢測了在顯性負相的⑶L4A水平升高后導致的 H0XB4的體內泛素化。D.為了確定⑶L4A和⑶L4B對內源性H0XB4蛋白水平的生理學效應， 純化了來自Cul4a和Cul4b敲除小鼠及其野生型同窩的骨髓干細胞和骨髓祖細胞，并用抗 H0XB4抗體進行免疫印跡分析。上圖顯示了通過PCR對CuWa7和Cul4b"小鼠的基因型 鑒定。E. HeLa細胞經6mg shCONTROL或6mg shCUL4A質粒轉染48小時，并進行SDS-PAGE 以及用抗CU4A抗體進行免疫印跡。將0肌動蛋白的水平確定為上樣對照。
[0023] 圖2.⑶L4A靶向多個H0X蛋白用于降解。通過用適當的抗體進行免疫印跡，確定 了轉染的CUL4A水平升高導致所示H0X蛋白的穩態水平有所降低。對應于MYC-CUL4A轉染 水平的升高，代表性的H0X旁系同源組蛋白的穩態水平有所降低，包括A.H0XA1、B.H0XA2、 C. H0XB7、D. H0XB8、E. H0XA11和F. H0XB13。0肌動蛋白的水平由免疫印跡確定為上樣對照。
[0024] 圖3.H0XB4同源結構域包含⑶L4A依賴性的降解決定子。A.對所有H0X旁系同源 組的同源結構域的序列比對發現保守的LEXE基序。B，C.H0XB4LEXE突變體的半衰期。在將 所述MYC標記的蛋白轉染進HeLa細胞、進行35S-Met標記，以及用抗MYC抗體進行免疫沉淀 之后，對H0XB4LEXE突變體（Ml:L175D;M2 :L175D、E176K;M3:L175D、E176K、E178K)進行了 脈沖追蹤分析。在每個時間點存留的H0XB4和所述LEXE突變蛋白的百分比都相對于時間 點0上的每個蛋白進行了基準化。示出了在每個時間點存留的H0XB4或LEXE突變蛋白的 百分比。D.通過用抗GFP或MYC抗原表位標簽或作為上樣對照的P-actin的抗體進行免 疫印跡，確定了在MYC-⑶L4A水平升高時得到的GFP-H0XB4同源結構域融合蛋白的穩態水 平。
[0025] 圖4.抗降解的H0XB4使得32D髓細胞系具有增殖優勢。A.通過用抗HA抗體進行 免疫印跡，確定32D穩定系中HA-H0XB4(野生型或突變的）的表達水平。B. 32D穩定系在無 血清培養基中的累積擴張。C.對HA-H0XB4(野生型的或突變的）在32D穩定系中的半衰期 進行放線菌酮追蹤分析。在所示時間點通過免疫印跡確定HA-H0XB4或HA-H0XB4(m)的水 平。將肌動蛋白的水平確定為上樣對照。D.在穩定表達所示轉基因的32D細胞中，通 過定量PCR(qPCR)確定H0XB4和H0XB4(m)的mRNA表達水平，并與感染了對照的MIGRI逆 轉錄病毒的32D細胞進行比較。將數據對相同細胞系中的b-肌動蛋白的表達進行基準化。 每個樣本的數據為三個平行樣。誤差條示于每個柱中。
[0026] 圖5.直接轉導抗降解的重組型H0XB4蛋白將G-CSF動員的⑶34+細胞維持在比野 生型H0XB4更原始的狀態。A.H0XB4在CD34+UCB細胞中的mRNA表達水平與在G-CSF動員 的⑶34+細胞中的mRNA表達水平的比較。B，C.在向G-CSF動員的⑶34+細胞中加入野生 型或抗降解的重組型H0XB4蛋白后，對粒細胞-單核細胞（CFU-GM)和紅系（BFU-E，CFU-E) 集落形成細胞進行比較。D.在加入野生型或抗降解的H0XB4蛋白后，對G-CSF動員的⑶34+ 細胞的限制稀釋CAFC測定法。E.在初次