促進干細胞分化為肝細胞的化合物的制作方法
【專利說明】促進干細胞分化為肝細胞的化合物
[0001] 本發明涉及使干細胞分化為更成熟化（adult-like)的肝細胞的化合物、其生產 方法以及含有它們的藥用組合物。
[0002] 在藥物研發過程中，十分需要體外培養方法（robust in vitro methods)用于肝 功能的建模。現有的采用人類原肝細胞培養物的方法具有眾所周知的不足之處，即捐贈者 與捐贈者間的變化性和功能上的不穩定性。同樣地，肝癌細胞系顯示了機能上的不足，而且 也存在腫瘤細胞系中固有的混雜遺傳異常。
[0003] 盡管多功能干細胞衍生的組織有希望解決捐贈者與捐贈者間變化性的問題，然而 迄今為止大多數檢測人類誘導性多功能干細胞（hiPSC)衍生性肝細胞的報告都顯示，這些 細胞相對于成人組織來說與胎兒組織更為相似，這可能會使得將其外推到成人體內的情況 更加困難。因此，需要更好的辦法使干細胞分化為更成熟或成人化的肝細胞，以生成用于藥 物發現、藥物功效和安全測試的更相關的模型。
[0004] 使hiPSC成功分化為成人化的肝細胞將促進用于治療慢性肝病的藥物發現工作， 此類肝病例如肝炎B病毒（HBV)感染。慢性的HBV(CHB)感染在全世界影響了約3. 5億人 口，存在巨大的未被滿足的醫療需求。現有的療法核苷抑制劑和干擾素（IFN)對清除病毒 不起作用，并且會產生病毒抗藥性和/或不良副作用。基于此類病毒基因組序列的變化性， 將HBV分為7種基因型（基因型A - H ;A - D為主要基因型）。HBV感染疾病的結果取決于 年齡和基因型。因此，大多數CHB感染起因于垂直（母到嬰）傳遞和/或童年感染。與之 不同的是，~90%接觸病毒的成年人能夠在6個月內清除HBV感染。此外，各種臨床數據顯 示病毒基因型影響HBV疾病的進程和對IFN療法的應答。也同樣已知，HBV能夠通過各種機 制避開宿主免疫反應，此類機制包括下調干擾素刺激基因（ISGs)。對于HBV和宿主先天免 疫間復雜的相互作用的更好的理解可能導致產生治療CHB感染的新的宿主/病毒靶點。然 而，探索新的、更加有效的HBV抗病毒藥的工作被生理學健全的體外培養系統的缺乏所阻 礙。用作生產物（producer)和靶細胞的現有的基于肝癌的系統既不是健全的，也不能包括 HBV基因型的多樣性。因此，極度需要新的體外系統，這種系統需要在生理學上更相關并且 支持（support)所有HBV主要基因型的強烈感染，優選得自臨床隔離群。此類系統不僅可以 作為藥物篩選平臺，而且還可以作為HBV疾病模型，包括干擾素響應基因型依賴性的評價。
[0005] 因此，仍然需要提高干細胞-衍生的肝細胞分化為更成熟的肝細胞，以支持 (support)各種基因型導致的患者的HBV強烈感染（robust infection)，供作為藥物篩選 平臺和疾病模型使用。
[0006] 本發明涉及式I化合物及其可藥用的鹽和酯：
[0007]
[0008] 其中R1 _R11如下文所定義。此外，本發明涉及制造和使用式I化合物的方法以及 含有此類化合物的藥用組合物。式I化合物用于使干細胞分化為更成熟或成年化的肝細胞 以用作藥物篩選平臺和在疾病模型平臺中使用。
[0009] 圖1提供了熱圖，顯示在采用多劑量實施例1化合物處理后整體肝細胞功能的基 因表達增加。生物熱圖通常用在分子生物學中，以代表對比一些可比樣本的許多基因的表 達水平（例如不同狀態的細胞、不同患者的樣本），這些樣本獲自cDNA樣本。圖1中，"綠 色"表示低表達，而"紅色"表示高表達。圖示的每行數據是相對的，生成從最低表達水平 (綠色）到中等水平（黑色）再到最高表達水平（紅色）的梯度。
[0010] 圖2顯示，在采用實施例1 -7化合物處理后，基于一組成熟相關基因的基因表達， 在誘導性多功能干細胞衍生的肝細胞中，各種肝細胞功能的基因表達增加。
[0011] 圖3A和3B顯示iCell肝細胞中強烈的HBV感染。圖3A為柱狀圖，顯示以實施例 1化合物處理的誘導性多功能干細胞衍生的肝細胞引起細胞對HBV感染的敏感性，這種反 應以劑量依賴的方式出現。圖3B為柱狀圖，顯示病毒感染被干擾素抑制（100IU/ml)。
[0012] 圖4A到4D顯示iCell肝細胞中全-基因型的HBV感染，為一系列柱狀圖，顯示 以實施例1化合物處理的誘導性多功能干細胞衍生的肝細胞能夠支持全部四種HBV主要的 基因型（A-D)的強烈感染。維持強烈病毒感染需要實施例1化合物的持續使用。在HBV 感染（6d)前采用實施例1化合物預處理細胞6d，或在感染期間預處理6天。干擾素（IFN) 用于顯示HBV感染的特異性。
[0013] 圖5為柱狀圖，顯示采用實施例1化合物處理的誘導性多功能干細胞衍生的肝細 胞支持從患者血清（臨床隔離群）中分離出的HBV的感染，而不是細胞培養衍生的病毒 (HepG2. 2. 15)的感染。采用實施例1化合物處理的iCell肝細胞支持患者衍生的HBV感 染，而不是細胞培養衍生的HBV感染。
[0014] 圖6A-I到6A-IV涉及HBV的感染性：血清與純化的病毒，為一系列柱狀圖，顯示 移除血清中存在的多余的HBsAg亞病毒顆粒（SVPs)是在采用實施例1化合物處理的誘導 性多功能干細胞衍生的肝細胞中獲得強烈HBV感染的先決條件。細胞在HBV感染前（6d) 采用實施例1化合物預處理6d。
[0015] 圖6BI和6B-II涉及由過量的HBsAg亞病毒顆粒（SVPs)中純化HBV病毒顆粒， 顯示純化的病毒（戴恩顆粒）由HBsAgSVPs中通過Optiprep梯度超離心分離。采用病毒 標記（HBsAg和HBV DNA)和電子顯微分析確認病毒的完全純化。
[0016]圖7a為采用實施例1化合物處理的誘導性多功能干細胞衍生的肝細胞的微陣列 分析（熱圖）。顯示上調和下調>2倍（2hr)、>3倍（24hr)或>6倍（7天）處理后的基因。 早在2hr時實施例1化合物下調干擾素-刺激基因（ISGs)。顯示在iCell肝細胞對HBV 感染易感性中也同樣可能起作用的兩個基因：顯示CREB3L1 (早在處理后2hr時引起下調） 通過其它病毒（HCV、WNV和DNA病毒）抑制感染細胞的增生，據報道SLC10A1 (在處理7天 后引起上調）為JBV受體。
[0017]圖7b涉及實施例1化合物對干擾素-刺激基因（ISGs)的作用，并提供餅圖顯示 實施例1化合物對誘導性多功能干細胞衍生的肝細胞中ISGs表達的動力學效應。975個干 擾素-刺激基因（ISGs)的列表以公共數據庫中已知的ISGs(參見表1)為基礎。
[0018] 圖7c涉及實施例1化合物對ISG表達（975基因）的作用，并提供了餅圖，顯示采 用實施例1化合物處理24hr和7天時所調節的ISGs的例子。975個干擾素-刺激基因 (ISGs)的列表以公共數據庫中已知的ISGs (參見表1)為基礎。
[0019] 表1顯示實施例1化合物對于ISGs在處理2hr、24hr和7天時的動力學效應（p 值〈〇? 05)。
[0020] 表 1
[0021]
[0022]
[0023]
[0024]
[0025]
[0026]
EGR1_[ .-48:8._|O'J棚_ HIF1A_ -4.78_丨ft.腦7_
1 PLSC'M,_ -2.59_(i 0087_
[0029]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034] 除另外說明外，在說明書和權利要求書中的以下具體術語和短語如下定義：
[0035] 術語"基團"指通過一或多個化學鍵與另一原子或分子連接從而形成分子中一部 分的一個原子或一組化學鍵合的原子。例如，式I中的變量R1-R11指與式I核心結構通過 共價鍵連接的基團。
[0036] 當述及具有一或多個氫原子的基團時，術語"取代的"指該基團中至少一個氫原子 被另一取代基或基團取代。
[0037] 術語"任選取代的"指（具有一或多個氫原子的）基團中一或多個氫原子可以但 不必須被另一個取代基取代。
[0038]術語"鹵素"指氟、氯、溴或碘。
[0039] 除另外說明外，術語"氫"指氫原子（-H)而非H2。
[0040] 術語"在iCell肝細胞中"指由國際細胞動力學（CellularDynamics International(⑶I))獲得的誘導性多功能干細胞衍生肝細胞。
[0041] 除另外說明外，術語"式化合物"指選自如該式所定義的化合物類的任一化合物 (包括任何此類化合物的任一可藥用的鹽或酯）。
[0042] 術語"可藥用的鹽"指保留游離堿或游離酸的生物有效性和性質的那些鹽，這些鹽 不是生物學或其它方面不可取的。此類鹽可以由無機酸形成，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝 酸、磷酸等，優選鹽酸；由有機酸形成，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二 酸、水楊酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、P_ 甲苯磺酸、N-乙酰基半胱氨酸等。此外，此類鹽可以通過向游離酸中加入無機堿或有機堿 制備。無機堿衍生的此類鹽包括但不限于鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽等。有機堿衍生的此類鹽 包括但不限于：伯、仲和叔胺鹽、（包括天然存在的取代的胺類）取代的胺類的鹽、環胺類的 鹽和堿性離子交換樹脂的鹽，例如異丙基胺、三甲基胺、二乙胺、三乙胺、三丙基胺、乙醇胺、 賴氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺樹脂等的鹽。
[0043] 本發明化合物可以以可藥用鹽的形式存在。本發明化合物還可以可藥用酯（即式 I酸的甲酯和乙酯）的形式存在。本發明化合物還可以溶劑化，即水化。溶劑化作用可在生 產過程中進行，也可以如由于初始無水式I化合物吸濕性質的結果（水合作用）發生。
[0044] 具有相同分子式，但其原子鍵合的性質或順序不同或其原子的空間排列不同的化 合物稱為"異構體"。原子空間排列不同的異構體稱為"立體異構體"。非對映異構體為在一 或多個手性中心具有相反構型且不為對映異構體的立體異構體。具有一或多個互相不可重 疊鏡像的不對稱中心的立體異構體稱為"對映異構體"。當化合物具有不對稱中心（例如， 如果碳原子與四個不同的基團連接）時，可能為一對對映異構體。對映異構體可以以其不 對稱中心的絕對構型表征，并由Cahn、Ingold和Prelog的R-和S-排序規則或者由分子 旋轉偏振光平面的方式定義，指定為右旋或左旋（即分別為（+)或（_)-異構體）。手性 化合物可以單獨對映異構體或其混合物形式存在。含有同等量的對映異構體的混合物被稱 為"外消旋混合物"。
[0045] 術語化合物的"治療有效量"指化合物的量，該量能有效預防、緩解或改善疾病癥 狀，或者延長接受治療的對象的生存期。治療有效量的測定在本領域內已知。本發明化 合物的治療有效量或劑量可以在較寬的范圍內變化，并且可以以本領域已知的方式決定。 此類劑量在每一具體情況中根據患者需求調整，所述具體情況包括服用的具體化合物、給 藥方式、需要治療的疾病，以及需要治療的患者。一般而言，在口服或腸胃外給予體重大 約為70Kg的成年人藥物時，適當的日劑量為約0?lmg-約5,OOOmg、lmg-約1，OOOmg或 lmg- 100mg，但是當需要時可以超過下限和上限。日劑量可以以單次量或分劑量給藥，或者 腸胃外給藥，也可以連續輸注的形式給藥。
[0046] 術語"可藥用的載體"可包括任何與藥物給藥相容的材料，包括溶劑、分散介質、包 衣材料、抗細菌和抗真菌劑、等張的